病理制片技术

常规制片工作包括组织取材、固定、脱水、包埋、切片、染色、封固等步骤。
取材 按病理检查的目的和要求，以及肉眼所见的病理变化从大体标本上切取适宜的组织块，以供制片镜检之用。注意取材应避免取坏死处，并且要切取病灶边缘和周围正常组织交界的部位。为了镜检和肉眼检查对照，必要时对组织作一定形式的标记。检查标本时，不要用齿镊，以免夹坏组织，造成人为变态。
切组织块的刀要锋利，刃要薄，并要有足够的长度。切组织时，要从刀的根部开始，将刀向后拉，用滑动的手劲切开组织，以避免挤压组织。组织一旦挤压，细胞就失去原有的形态。组织块的厚度不要超过0.3cm。取切组织后，立即投入固定液。
固定 活检或实验动物以及尸检切取的组织，都应立即投入足量的固定液中固定。固定的目的是：
❶防止组织自溶和腐败。组织离体或机体死亡后，组织就失去血液循环所供应的氧及养料等，致使组织发生自溶。其原因可能是细胞溶酶体的破裂，释放组织蛋白酶，某些组织蛋白酶可把蛋白质分解成肽类等，以后羧肽酶及氨基肽酶再把肽破坏而成氨基酸。这时组织或细胞就失去了原有的形态，发生自溶。自溶的组织在室温下极易引起细菌的繁殖，引起组织的腐败。固定就可制止上述过程。如能在4℃环境中固定就更好。
❷使组织成分(蛋白质、脂肪及糖)凝固或沉淀，避免组织成分弥散，使之尽量保持与原来的结构相似的状态。
❸固定有利于染色反应。为了不同染色的目的要选择适宜的固定液，否则还需进行二次固定。如一般的固定液为福马林生理盐水，但如欲染Masson三色染色，最好是用甲醛升汞、Zenker液或Bouin液固定。检查嗜铬细胞瘤，宜用Zenker固定液（含铬）。检查细胞内糖原用Carnoy固定液。
固定液的种类很多，最常用的为福马林 (即40%甲醛水溶液)。为了避免甲醛氧化所生成的蚁酸在组织中与血红蛋白结合产生棕色的福马林色素，最好采用中性福马林固定。其他比较常用的固定液有以下一些。
Zenker固定液：含氯化汞及重铬酸钾等。适用于结缔组织染色。
甲醛升汞固定液： 含氯化汞及甲醛。可以提高酸性染料的着色，常用于三色染色。
Bouin固定液：含苦味酸、甲醛、醋酸，适用于结缔组织染色。
Carnoy固定液： 含酒精、氯仿和醋酸。穿透力强，一般3mm厚的组织，1小时内即可得到固定。适用于糖原、DNA和RNA染色。
甲醛钙固定液： 含氯化钙及甲醛。特别适用于固定脂肪组织和组织化学染色。
95%或100%乙醇：适用于糖原染色，如染肝组织、阿米巴原虫、尤文瘤等的糖原时。
如欲固定组织中的可溶性物质，要使用蒸气固定法。常用的为甲醛蒸气。如为冷冻干燥组织，一般是使用三聚甲醛加热产生的蒸气固定。
如欲制备1μm厚半超薄切片，可先用戊二醛固定组织，后再用四氧化锇进行第二次固定。或只用三聚甲醛固定亦可。
由于不同的固定液的穿透力不同，组织块的厚薄不同，所以不同的固定液要求固定的时间长短不一样。固定时间一般为3～24小时。
脱钙 如组织含有钙盐(如骨、钙化灶等)，必须在脱水前将钙脱去。理想的脱钙方法要求作到完全脱去钙盐，而对组织无损害，对染色也无不良影响。常用的脱钙方法有以下几种。
(1)酸性溶液： 可用硝酸、蚁酸、枸橼酸、醋酸或盐酸等为主的液体。但常规制片中最常用的为硝酸或蚁酸。
(2)离子交换树脂法： 原理是减少溶液中的钙离子，以促使组织中的钙更快地溶解于溶液中。
(3) 螯合剂： 原理是利用某些有机化合物如乙二胺四醋酸(EDTA)，对钙所具有的强结合力使组织脱钙。组织可在EDTA中放置几个月而对染色没有什么影响。缺点是需要时间较长(2周至3个月)。
(4) 电泳脱钙法： 利用电泳时钙离子向阴极移动的原理。如温度提高(如40～45℃)还可加快脱钙的速度。这个方法由于优点不多，故多已不采用。
脱水 固定的组织在石蜡包埋前，必须将水分脱去，这个过程称为脱水。最常用的脱水剂是乙醇。一般脱水首先将组织浸入60～70%乙醇，随乙醇浓度的不断增高直至纯乙醇时，组织中的水分已减少到极低的程度。除乙醇外，可作脱水剂的还有二恶烷、正丁醇、四氢呋喃、丙酮等。丙酮的脱水作用比乙醇强，但使组织有明显的收缩。有的实验室采用加温脱水的方法，以加速脱水过程，其缺点是组织收缩现象较为明显。
透明 组织脱水后，必须经过透明才能浸蜡，因为酒精是不能与石蜡相互溶解的。二甲苯是最常用的透明剂，它与酒精及石蜡均能相互溶解。它的优点是穿透力强，作用快。缺点是组织收缩显著，如时间超过2～4小时，组织将变脆。除二甲苯以外，氯仿、四氯化碳、苯、甲苯、香柏油、汽油、煤油等均可作为透明剂。氯仿的最大优点是组织在其中浸泡过夜也不致变脆，缺点是浸透力较二甲苯弱，易挥发，价格较贵。四氯化碳与氯仿作用相似，价格较低，与氯仿均非易燃品，但有毒性。苯及甲苯作用与二甲苯类似，组织较不易变脆，但浸透力较小。香柏油在理论上是一个较理想的透明剂，它对组织很少起硬化作用，组织长期放置其中也极少损害，但较其他透明剂手续麻烦，故现在很少使用。
浸蜡 组织透明后，需进入溶化的石蜡中浸泡，以使石蜡脱去组织中的透明剂并便于包埋，这个过程称为浸蜡。浸蜡箱要使温度保持在60℃左右。所用石蜡的熔点要依不同的组织及室温等而定。如标本为坚硬的纤维组织或室温较高时，则宜用溶点较高的(如60℃)石蜡。如为软组织(如胎儿组织，脂肪组织等)或室温较低时，则宜在熔点较高的石蜡中加入适量的熔点较低的(如45℃)石蜡，组织块在石蜡中不宜浸泡时间过长(应在4小时以内)以免组织变脆。
包埋 组织块经过浸蜡后，要铸在石蜡中，以便于切片机切片，这个过程称为包埋。包埋用的石蜡和浸蜡一样，要看组织的硬度及室温的高低，采用不同熔点的石蜡。包埋的石蜡温度与浸蜡的石蜡温度应相差不大。否则切片时有发生石蜡与组织脱离的可能。包埋的石蜡温度也不可过高，以免组织变脆。包埋后，蜡块一旦凝固，应立即投入冰水中，以使石蜡迅速凝固收缩，使石蜡与组织紧密结合。
包埋，除目前常规使用的石蜡包埋外还有以下几种。(1) 碳蜡包埋： 碳蜡又名多乙烯二醇蜡，是一种水溶性蜡，在50℃即呈液态，故组织无需经脱水、透明等过程，只要在50℃条件下把组织相继浸入70%、 90%、100%碳蜡中即可。且可保存组织中脂质，进行脂肪染色。 但碳蜡质脆，切片困难较大。 由于碳蜡能溶于水，切片须飘浮在染液中进行染色。
(2) 火棉胶包埋： 火棉胶为二硝酸纤维素与三硝酸纤维素的混合物。 火棉胶包埋可在室温下进行， 因而可以避免组织的明显变形、收缩及扭曲等。较适用于大切片以及神经组织、眼球等的切片。 由于需要时间较长，价格较贵，且不适宜于染酸性粘多糖（因为火棉胶也着色），故一般常规制片中多不采用。
(3) 明胶包埋： 在冰冻切片时，如组织为易碎的或碎屑，可将组织在明胶中包埋，以便于切片。
(4) 双重包埋： 坚硬组织（如骨组织）制片时可用双重包埋法。 先将组织浸火棉胶，用氯仿使火棉胶硬化并使组织透明后，再用石蜡包埋。如欲切制连续切片，使用这种方法较好。
切片 现在常使用的有石蜡切片、冰冻切片、恒冷切片、火棉胶切片、半超薄切片等。
(1) 石蜡切片： 用石蜡包埋的蜡块制做切片，是现在病理实验室常规使用的切片。一般要求切4～6μm厚的切片，如需要，有经验的技术工作者也可切制1～2μm厚的切片。有时为了观察病变的连续性，还可进行连续切片。
(2) 冰冻切片： 用于活检的快速组织学诊断，显示脂质或酶的活性，免疫荧光的观察，以及为了神经组织学的镀银或镀金等染色法时。要进行冰冻切片的组织可以先经过固定，也可以用未经固定的组织。其法是先使组织迅速冰冻变硬，以便于进行切片。冰冻的方法是用氯乙烷、液化CO₂、或半导体致冷，经切片后，组织片可在染液中进行飘浮染色，也可以先将组织片贴附于玻片上进行染色。一般冰冻切片要求8～10μm厚。如染脂肪，则应切10～15μm厚。如为了进行组织化学和免疫荧光的研究，则需用恒冷切片机，切制3～5μm厚的切片。
(3) 恒冷切片： 使用恒冷切片机切片。恒冷切片机特点为组织切片在一恒冷(-15～-30℃)的冷箱内进行，切片刀亦预冷到相同的温度。一般恒冷切片机内都附有防止切片卷曲的设备。防卷曲设备的塑料片应距刀刃0.5～1.0mm。切片后，防卷曲设备即收回到原位，这时用特制的凹形橡皮头吸着载片或盖片使之与切片接触，切片即可粘附于载片或盖片上。之后，再按要求将切片固定于固定液中，进行染色等。
(4) 火棉胶切片： 用火棉胶包埋的组织制片。一般常用滑动式或撬板式切片机。切片前先将火棉胶包埋的组织块的一侧浸入乙醚中片刻，待火棉胶稍溶解，再用8%浓火棉胶液将组织块粘附在金属的或木制的支持器上，待其粘附牢固后，将它装在切片机上，即可切片。
(5) 半超薄切片： 如切片刀磨得极为锋利，在有经验的技术工作者，用轮转式切片机，也可用石蜡包埋的组织块（小块）切出1μm左右厚度的切片。但一般先用戊二醛液固定组织，再用四氧化锇二次固定(用三聚甲醛固定
性蜡，在50℃即呈液态，故组织无需经脱水、透明等过程，只要在50℃条件下把组织相继浸入70%、90%、100%碳蜡中即可。且可保存组织中脂质，进行脂肪染色。但碳蜡质脆，切片困难较大。由于碳蜡能溶于水，切片须飘浮在染液中进行染色。
(2) 火棉胶包埋： 火棉胶为二硝酸纤维素与三硝酸纤维素的混合物。火棉胶包埋可在室温下进行，因而可以避免组织的明显变形、收缩及扭曲等。较适用于大切片以及神经组织、眼球等的切片。由于需要时间较长，价格较贵，且不适宜于染酸性粘多糖（因为火棉胶也着色），故一般常规制片中多不采用。
(3) 明胶包埋： 在冰冻切片时，如组织为易碎的或碎屑，可将组织在明胶中包埋，以便于切片。
(4) 双重包埋： 坚硬组织（如骨组织）制片时可用双重包埋法。先将组织浸火棉胶，用氯仿使火棉胶硬化并使也可)，乙醇脱水，环氧树脂包埋；包埋后用玻璃刀在超薄片机上切片。
染色 见“染色”。
封固 切片染色后，为了便于显微镜观察及长期保存，须封固。封固是在已染色的组织片上加适量封固剂后覆以盖玻片。
封固剂一般有水溶性和树脂性两种。水溶性封固剂(屈光指数为1.4～1.42)多用于脂肪染色、异染性染色、免疫荧光染色等，其主要成分为糖浆、明胶、阿拉伯胶等。树脂性封固剂(屈光指数为1.5左右)有天然树脂及合成树脂，最常用者为加拿大树脂。为了避免退色，用碱性亚尼林染色的切片不宜用酸性封固剂，普鲁士蓝反应的切片不宜用有还原性的封固剂。