病原物降解酶degrading enzymes of pathogens

病原物产生的对寄主植物细胞壁组分有降解作用的酶类。在病原物摄取营养和消解植物抗侵染机械屏障中起作用。病原物降解酶种类很多，除少数外均能分泌到体外。有些降解酶与寄主组织成分或其降解产物之间存在着明显的调控关系。
种类 根据酶作用于植物的部位，分为角质层降解酶和细胞壁降解酶等，但通常根据酶作用的底物，分为角质酶(cunase)、果胶酶(pectic enzymes)、纤维素酶(cellulase)、半纤维素酶(hemicellnlase)、蛋白酶(protease)。
角质酶 一种脂酶。在碱性条件下(pH值为9～10)最适于催化水解角质，产生寡聚体后再降解为单体。催化过程是先经酰化作用从醇脂基中产生醇，再经脱酰基作用产生脂肪酸(图1)。发现22种植物病原真菌能产生角质酶。

图1 角质酶作用机制
HOR——链 ⊖——负电荷

果胶酶 包括一组能对果胶分子中鼠李半乳糖醛酸链产生作用的酶类，通常分为两类： ❶果胶甲基酯酶(pectin methyleste rase),
❷果胶水解酶(pectichydrolases)和果胶裂解酶(pectic lyases)(图2)。作用是从果胶质中除去甲基基团以产生果胶酸。作用方式是在糖C₆部位的羧基处水解每 一个α-1,4连接的半乳糖醛残基产生一个糖醛酸羧基和甲醇。

图2 几种果胶酶的作用机制

PMG: 果胶甲基半乳糖醛酸酶（一种果胶水解酶）
PATE: 多聚半乳糖醛酸转移消除酶（一种果胶裂解酶）
PME:果胶甲基酯酶(简称PME)

果胶水解酶和果胶裂解酶 共同作用特点是使α-1,4糖苷键断裂。不同的是，水解酶作用部位是α-1,4键使果胶中的聚半乳糖醛酸水解，释放出单体的半乳糖醛酸，果胶甲基半乳糖醛酸酶(pectinmethylgalacturonase简称PMG)和多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase简称PG)是两种分别以果胶质和果胶酸为基质的水解酶； 裂解酶又叫转移消除酶，作用部位除α-1,4键外，还由于消除了第五个碳原子上的氢，而最终释放出不饱和的二聚体。果胶质甲基转移消除酶(pectin methltrans-eliminase简称PMTE) 和 多 聚半乳糖醛酸转 移消 除酶(polygalacturonic acid trans-eliminase简称PGTE)是分别以果胶质和果胶酸为基质的两种裂解酶。水解酶的作用不需要Ca ⁺⁺，适宜酸碱环境为pH值为4～6. 5; 裂解酶的作用需要Ca⁺⁺，适宜酸碱环境pH值为8。另外，根据果胶酶对底物分子的作用部位又分为内裂和外裂果胶酶，它们分别使果胶键从中间或两端开裂。
纤维素酶 是 一组复合酶，至少有三种酶参与纤维素降解(图3)。首先是内1,2-β-D葡聚糖酶(EG)的作用，使完整的葡聚糖链中的糖苷键随机裂解，暴露出非还原性末端。1,4-β-D葡聚糖纤维二糖水解酶(CBH)以葡聚糖链暴露出的非还原性末端为基质水解产生纤维二糖。最后由β-葡萄糖苷酶(β-G)使纤维二糖水解成葡萄糖，菊欧氏杆菌。立枯丝核菌、齐整小菌核菌等多种能分解纤维素的病原物都能产生纤维素酶。
半纤维素酶 将各种半纤维素降解为单糖，主要种类有木聚糖酶、半乳聚糖酶、葡聚糖酶和阿拉伯聚糖酶等。苜蓿黄单胞菌（苜蓿叶斑病菌）至少产生三种木聚糖酶，根据在反应物中出现的先后次序分别为外木聚糖酶、内木聚糖酶和木聚糖苷酶。
其他酶类 蛋白酶(protease)、淀粉酶(alnylase)、磷脂酶(phospholipase)等分别降解蛋白质、淀粉和脂类物质。
致病作用 病原物都可以产生不同类型的降解酶。在致病中起作用的降解酶必须经过一定的鉴定程序。已证明在致病中起作用的降解酶可以使组织浸离和细胞死亡。
鉴定程序 确定病原物降解酶在致病中起作用的实验证据，包括以下内容： ❶病原物在体外产生降解酶的能力。
❷病原物致病力与产酶能力的关系。
❸病原物致病力丧失与产酶能力丧失的关系。
❹纯化酶制剂重现症状和破坏植物组织结构的能力。
❺受降解植物组织结构和成分变化的影响以及降解产物的出现。
❻酶的抑制与减症作用的关系。

图3 纤维素酶（复合酶）的作用机制

EG: 内1,2-β-D葡聚糖酶
CBH:1,4-β-D葡聚糖纤维二糖水解酶
BG: β-葡萄糖苷酶
(仿A.R.White 1982)

对侵入的作用 在侵入中起作用的主要是角质酶。有些植物病原真菌产生角质酶，使孢子下角质层分解，形成有光滑边缘的圆形侵入孔。
对组织浸离的作用 组织浸离是果胶降解酶使植物细胞间起粘合作用的果胶多聚体分解，组织中细胞分离的结果，是多种植物软腐病的共同特征。除果胶降解酶外，还有一些非果胶降解酶如镰刀菌和疫霉的内β-1,4-半乳聚糖酶及其他未知因子与组织浸离有关。
对细胞死亡的作用 植物细胞死亡是胞壁降解酶(cell wall degrading enzymes)的作用。胞壁降解酶是病原物产生的分解细胞壁成分酶的总称，包括果胶酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶等。其作用有直接作用和间接作用。直接作用是细胞壁成分降解后，丧失对原生质体的支持能力，因膨压增加引起膜破裂和膜伸展。由于单一果胶酶并不损害分离的原生质体以及植物细胞壁结构的复杂性，胞壁降解酶的上述作用牵涉到多种酶的综合作用。间接作用是胞壁降解酶作用于植物组织后释放有毒物质造成细胞死亡。
影响因素 病原物降解酶的产生受遗传因子控制和环境因子调节。
遗传因子 已鉴定的病原物降解酶基因有角质酶基因、果胶酶基因、纤维素酶基因和蛋白酶基因。
角质酶基因 从茄类镰孢豌豆专化型（豌豆根腐病菌）分离的角质酶基因含有690个核苷酸的开放阅读框架和单一的51个碱基对的内含子。表明角质酶在该病菌致病过程中起重要作用的证据有： ❶病菌分泌角质酶。
❷病菌能以角质为唯一碳源生长。
❸角质诱导病菌角质酶RNA的积累。
❹角质酶抗体和化学抑制剂对病菌致病性有明显抑制作用。
❺自然变异和紫外线诱变的菌株经遗传分析证明致病性与产角质酶能力呈正相关。
❻将豌豆根腐病菌的角质酶基因转移到番木瓜果腐病菌中后，后者的致病特征发生改变，从原来只能从伤口侵染变为能侵染无伤果实。但1992年德国斯塔尔和谢弗(D. J. Stahl和WilhelmSchafer)以基因缺失法得出的结论认为角质酶在致病中不是必须的。
果胶酶基因 从软腐欧氏杆菌Erwinia spp.分离鉴定的果胶酶基因有果胶酸盐裂解酶基因、多聚半乳糖醛酸酶基因和果胶甲基脂酶基因等。从菊欧文氏菌克隆鉴定的果胶酸盐裂解酶基因有5个(peLA—E)，在染色体上形成两簇，一簇含peLB和peLC，另一簇含peLA,pelD和peLE。这5个基因编码的5种同功酶PLa—PLe分别在细胞浸离和组织腐烂中起作用。PLe浸离活性最强，其次是PLb和PLc，而PLa无浸离活性。缺失突变体分析表明，peLB-和peLC-突变体致病性不变，peLA-突变体致病性明显减弱，peLD-,peLE-或peLD-E- 突变体则丧失致病性。多聚半乳糖醛酸酶基因(peh)已在胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种和青枯病假单胞菌中克隆鉴定。在有些胡萝卜软腐欧文氏菌中peh基因与pel基因连锁。peh 1基因产物能浸离马铃薯薯块，但标记交换突变体缺失内-聚半乳糖醛酸酶，保留外-聚半乳糖醛酸酶活性的仍有致病性。青枯假单胞菌的多聚半乳糖醛酸酶基因在病程中有些作用，但并非必需。
纤维素酶基因 从很多植物病原真菌和细菌克隆鉴定出的纤维素酶基因的产物是内β-1,4-葡聚糖酶。该基因在不同病原物中与致病性的关系有差别。内-葡聚糖酶基因(egl)与青枯假单胞菌的致病性有明显关系，在油菜黄单胞菌油菜致病变种（甘蓝黑腐病菌）中也有一定作用。从菊欧文氏菌克隆鉴定的两个内-葡聚糖酶基因(ceLZ,ceLY)与致病性的关系尚未肯定。
蛋白酶基因 从甘蓝黑腐病菌中克隆的蛋白酶基因与致病性有一定关系。从菊欧氏杆菌中得到4个克隆，分别编码蛋白酶A、B、C和一个蛋白酶抑制因子，其基因成簇排列在约40kb的DNA片段上，其中还包括编码分泌功能的因子。这些蛋白酶在致病中的作用尚需进一步肯定。
调节机制 主要表现为受底物或底物降解产物的诱导和抑制。
诱导作用 有些降解酶，病原物产生的基础水平很低，但当有底物存在时，基础水平酶作用后的产物对该病原物的产酶活性有明显增强作用，如角质单体对角质酶的诱导和二聚体半乳糖醛酸对果胶水解酶的诱导。病原物侵染具有完整角质结构的寄主时，首先被诱导的是角质酶，接着是果胶酶、半纤维素酶、最后是纤维素酶。胞壁降解酶的这种诱导作用和分解代谢物的抑制作用形成一定的平衡关系。
抑制作用 病原物中受底物或底物降解产物诱导的酶，当该底物降解产物浓度很高时，其活性受抑制，这种现象称为代谢物抑制作用。病原物一些组成型表达的降解酶没有这种代谢物抑制现象。基质中的高浓度葡萄糖也有抑制酶的作用。这种作用又称葡萄糖效应。