激光拉曼光谱laser Raman spectrum

光线通过某些物质的溶液后，除可观察到与入射光频率相同的强度较强的端利散射光外，还可观察到与入射光频率不同的强度很弱的散射光。这一现象是由印度物理学家拉曼于1928年首先发现，故称拉曼散射。激光拉曼光谱就是以激光为光源所测得的物质拉曼散射光谱。

激光拉曼光谱

激光拉曼光谱是一种以激光为光源的散射光谱，属于分子的振动一转动光谱。由于激光的单色性好，相干性强，功率大，从而使激光拉曼光谱克服了用汞弧作光源观察的一般拉曼散射谱光谱灵敏度低、样品用量大，摄谱时间长等缺点。
工作原理 单色光与物质分子相互作用时，部分被吸收，部分向各个方向散射。散射光可分裂为若干不同波长的谱线，其中最强一条(约为入射光强度的10^-5)，称作瑞利散射线。还有一些很弱的谱线 (约为入射光强度的10-7)，其波长或比入射光波长短，或比其更长。这种现象是1928年印度物理学家Raman研究液体苯散射时发现的，称为拉曼效应。这类谱线称作拉曼散射线。
散射是光子与物质分子碰撞的结果。碰撞分两类： 一类为“弹性”碰撞，光子与物质分子不发生能量交换，散射光的频率与入射光相同； 另一类为“非弹性”碰撞，碰撞过程中，分子和光子之间发生能量交换，散射光的频率与入射光不同。散射光与入射光频率之差(△v)称作拉曼位移，相应于分子振动、转动能级的变化(图1)。处于基态V₀振动能级的分子，受能量为hv的光子激发，跃迁至一个不稳定的能级（图中虚线所示），如果分子返回基态V0振动能级，散射光子的能量与入射光子相同，频率不变，这就是瑞利散射。如果分子受激后，只回到基态的V1振动能级，由于分子吸收了光子的部分能量，则散射光子的频率比激发光子的频率小△v。另一种情况是处于基态V₁振动能级的分子受激后没有返回到V₁能级，而回到V0能级，分子的部分能量转给了光子，故散射光子的频率比入射光子的频率高△v。低于入射光频率的散射线称斯托克斯线，高于入射光频率的散射线称为反斯托克斯线。反斯托克斯线更弱，通常只测斯托克斯线。图中虚线并非分子的能级，它只表示分子起始状态的能量加上光子的能量，因此可以用不同频率的单色光激发分子，而拉曼位移值却都相同 (都等于V1和V0之差)。由于红外光谱也起源于分子的振动一转动能级的跃迁，它们同为分子振动、转动光谱。若把拉曼光谱的激发光频率人为地定为零，则拉曼谱线（位移）的频率和红外吸收谱线的频率将一致。但不是所有振动都反映在拉曼光谱或者红外光谱上，只有那些在振动过程中有极化率α（单位电场所产生的极化强度称为极化率）变化的振动才有拉曼活性。例如，CO₂分子有四种振动(图2)，在振动Ⅰ中，两个C—O键同时伸长，同时缩短，α随之改变，在拉曼光谱中可看到频率v₁。在振动Ⅱ中，一个键伸长，一个键缩短，极化率变化相互抵销，v2不能反映在拉曼

图1 分子能级跃迁示意图

光谱上。振动Ⅲ和Ⅳ等同，Ⅳ中(+)表示向纸外运动，(-)表示向纸内运动。它们只有键角弯曲，没有键长改变，α变化很小，ν3不能在拉曼光谱中观察。另一方面、红外活性必须伴随有偶极矩变化，振动Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ都有偶极矩变化，在红外光谱中看得到。振动Ⅰ的两个键同时伸长，同时缩短，分子的偶极矩始终等于零，它是红外惰性的。许多振动既能出现于红外光谱，也能出现于拉曼光谱。一般说来，红外谱带越强，拉曼谱带就越弱，反之也然。

图2 CO₂分子的振动

激光拉曼光谱仪 由光源、样品装置、单色器、检测放大与记录系统四个部分组成(图3)。该谱仪一般配有氦氖激光器 (波长为632.8nm)和氩离子激光器(波长514.5nm,488.0nm)两种光源。前者功率较小（几十毫瓦），后者功率较大 （几百毫瓦） 为了减少杂散光，提高分辨率，一般采用双联单色器或者三联单色器。散射光在与入射光成90°角的方向收集。

图3 激光拉曼光谱仪示意图

实际应用 激光拉曼光谱的谱带丰富，各种化学基团有其特征的频率位移，谱带的强度和分子的几何形状、振动方式有密切的关系，故可用这些谱带来鉴别物质，测定分子结构，研究分子内部和分子间力的相互作用以及由于这些力的作用而起的结构变化等。激光拉曼光谱广泛用于无机、有机、高分子、环境保护、食品、纺织品等多种学科。特别在生物科学方面，可以用来研究蛋白质与核酸的一级、二级结构； 酶与底物的相互作用； 小分子和大分子的相互作用； 膜的结构和功能； 肿瘤细胞和正常细胞的差异； 病毒的结构特征等。例如，当一个血红蛋白分子与氧结合，或与氧分开时，其激光拉曼光谱就会显示明显差别，可见这项技术对研究血红蛋白氧合过程的分子生物学机理，提供了有利手段(图4)。一个纯的核酸或者蛋白质有30～40条拉曼线在300～1700cm-1范围内，由此可获得核酸的有序结构，碱基堆积，蛋白质的主键构象(α螺旋、β折叠、自由卷曲)，侧链残基的构型及所处环境等多种信息。拉曼光谱有许多优点，如某些红外不敏感的基团S—S、C—C、N—N键有强的拉曼谱线； 样品处理方便，可用玻璃作样品池，用水作溶剂，它们对图谱的干扰很小，有利于在水溶液中研究生物大分子的结构功能关系，这样更接近生物分子的天然存在状态； 激光的使用，使样品的用量减至很少 （可少至几微克），可以用来研究来源困难的生物样品； 拉曼光谱是一项散射技术，与一般透射技术不同，它不需要样品透明，天然材料也可以不被破坏，固体、液体都可以测量。目前已发展了以拉曼散射为基础的 “分子微探针”技术。活的生物组织的研究亦有报道。例如，使用一毫瓦的激光、照射在一个完整的牛眼睛上，研究蛋白质残基的分布(蛋白质残基的分布被认为与眼睛的老化，白内障的形成有关)，在强化视象检测器的帮助下，可以获得很好的图谱，这样低的功率已不致伤害视网膜。可以预料，激光拉曼光谱应用在医学上，有宽广的前途。

图4 血红蛋白激光共振拉曼光谱