毒理学动物实验

研究毒物对人体的作用，除了直接通过流行病学及临床观察外，主要是借助动物实验，以阐明毒物的毒性、毒理作用、剂量-反应关系，确定阈剂量及无作用剂量，为制订卫生标准提供初步依据。
由于许多实验研究不能直接在人身上进行观察，因此动物实验就特别重要。由于动物对毒物的敏感性存在种属差异，动物实验的结果不能直接应用于人，但是根据人接触毒物的实际情况，用多种动物进行实验，可以预测毒物对人毒作用的一般规律。一般动物实验应在人接触某种毒物之前进行，这样可为以后对人毒理研究提供观察指标及安全剂量范围。一般来说，动物中毒的表现，可以预示人在中毒时哪些器官和系统可能受损，如动物汽油中毒时主要表现为兴奋-抑制过程紊乱，提示汽油可损害中枢神经系统。又如毒物在动物体内代谢和排出的资料，往往有助于了解毒作用和解毒机理，并可提供实验室诊断的指标。亚急性和慢性动物实验则是制订卫生标准不可缺少的步骤。
动物实验的优点是：
❶在接触毒物和观察其效应的过程中，可以严格控制实验条件。例如使动物染毒剂量和时间相对地固定，避免毒物混合接触，排除其他干扰因素，使动物的实验环境和生活条件标准化。
❷可以通过对动物的活检、大体解剖以及病理组织学检查所见的变化来确定毒作用的性质及部位。
❸可以在动物身上预测化学物致癌、诱变及致畸等的潜在危害。
动物实验也有缺点：
❶由于动物种属、品系、健康状况等不同而造成对毒物敏感性的差异，致使动物实验结果用于预测对人的毒性时有一定困难。
❷人的寿命和生物学反应与动物不同，特别是人与动物的代谢过程及速率常不一样。
❸从动物身上难以得到人对毒物反应时的主观感觉的资料。
❹由于所用动物的数目有一定限制。其结果的可靠性常是相对的。动物实验所得无作用剂量，通常只是从一个实验得到，因而其结果有一定的局限性。例如，假设某一剂量的化合物，只引起1%的动物出现毒作用（如发生肿瘤），当用100只动物做实验时，则在重复多次的实验中，反应率为零的结果可达37%的概率 (根据二项分布定律： 如总体的毒性反应率π=0.01，则用100个动物做实验时，出现反应率为零的概率P0= (1-π)¹⁰⁰＝0.37或37%)。如果对照组动物中也出现同样反应的话，则在实验组内所得反应率的意义就更小了。
实验动物的选择很重要。常用的动物有小鼠、大鼠、豚鼠和兔，有时也用猫、狗和猴等高级哺乳动物。除温血、哺乳动物外，在环境毒理实验中，还要用鱼类等水生生物。动物的选择首先应满足实验的要求，其次应容易获得，经济，易饲养、管理等。对实验动物的选择应注意以下几个问题：
1. 种属选择： 动物种属和品系的不同造成一系列形态和功能的差别，对毒物敏感性的差异。种属差异除造成毒性表现在量方面的不同外，有时还有明显的质的不同。不同品系对毒物敏感性的差异，没有种属差异明显，且主要是量的差异。为了较准确地估计对人的毒性，应尽可能选择对毒物的反应和代谢与人近似的种属作实验。不是所有温血动物或哺乳动物的反应均和人相似。如苯引起兔的血象变化和人相似，而狗却出现完全不同的反应； 苯胺及其衍生物对人引起高铁血红蛋白血症，而对小鼠则不形成。因此还须根据受试物的特点，选用对该毒物敏感性较高的动物。下列情况可供选择动物时参考： 研究作用于血液及胃肠道的毒物时，可选用猴。近亲繁殖的动物在遗传方面很相似，适用于比较毒性的研究；而近群随意交配的动物，即杂交的第一子代可用于一般毒性实验。研究气体、蒸气对粘膜的刺激，最好选用猫； 研究毒物对皮肤的局部作用时，选用豚鼠、兔；研究过敏性反应时选用豚鼠； 研究某些神经毒性反应时用家禽（尤其是鸡），如研究有机磷农药的迟发性神经毒作用，一般采用成年鸡。通常急性毒性试验多用小鼠，而慢性毒作用的观察，则应选择寿命较长、对疾病抵抗力较强的动物，如大鼠、兔、狗等。生殖及致畸实验研究通常用大鼠、小鼠、兔及豚鼠。研究化学物致癌作用时以大鼠及小鼠较为合适。小鼠传统地用于研究化学物对皮肤的致癌作用； 诱发膀胱癌则用狗，近年来发现地鼠也是诱发膀胱癌很好的一种模型。有条件时可采用剖腹产取得的、在严格消毒条件下培育的“无特异性病原体”动物来进行致癌等实验。在细胞遗传学研究中，常用小鼠、大鼠及中国地鼠。
2. 个体选择： 动物对毒物的反应存在个体差异。为了减少实验误差，除了注意种属选择外，还应注意个体选择。个体选择条件包括动物的年龄、体重、性别、生理状态及健康状况等。
(1) 年龄及体重： 年幼动物一般较成年动物对毒物的敏感性大些。应根据研究任务来选择适龄动物。急性实验一般选用成年动物。慢性毒性试验，因实验时间较长，同时要观察动物的生长发育状况，应选用较年幼的或初断乳的动物。在同一批实验中，动物的年龄、体重应尽可能一致，如果体重相差悬殊，则易增加动物反应的个体差异，影响实验结果。动物的年龄常根据其体重来推算。

常用实验动物的生活年限及体重选择

动物 种类	生活年限 （年）	成 年		体重选择范围(g)
		时间 （月）	体重 (g)	急性实验	慢性实验
小鼠 大鼠 豚鼠 兔 猫	1.5～2 2～2.5 6～8 4～9 10～12	2 3 2 3～4 3～4	15 150 250 1,500 1,000	18～25 150～240 200～250 1,500～2,000 1,500～2,500	15～18 50～100 150～200 1,200～1,500 1,000～1,500

(2) 性别： 动物性别不同对毒物的敏感性也不同，这与性激素有关，也随受试毒物而异。一般雌性动物较雄性动物为敏感，但也有相反的情况。例如对马拉硫磷、甲基对硫磷等农药，雄性动物的敏感性较雌性动物为高。性别的影响较种属差异要小。如果实验对动物性别无特殊要求，则宜选用雌雄动物各半。
(3) 生理状态： 动物的特殊生理状态如妊娠、哺乳等对实验结果影响很大。毒理试验通常不采用妊娠、哺乳期的动物。如在试验过程中，发生动物怀孕，则体重及某些生理生化指标均可受到严重影响，有时应将怀孕的动物剔除。但为了某种特定的目的，如阐明毒物对生殖功能和后代的影响(如致畸、三代繁殖实验等)，则大鼠、小鼠最适用，因为它们全年都有动情周期的循环，并且生殖周期短，便于进行实验观察。
(4) 健康状况： 必须选择健康的动物，即发育正常，体形丰满，被毛光泽紧贴体表，活动迅速，眼、呼吸道无异常分泌物，饮食和排便正常。为了确定实验动物是否健康，须在实验前观察7～10天。由于实验动物的饲养和管理直接关系到动物的健康和生长发育，外界因素的任何改变，例如营养、环境条件等，都可能改变动物对毒物的反应，从而影响实验结果。这在慢性实验中尤为重要。因此必须保持饲料及其他环境因素的稳定性和标准化，以保证动物的健康。
毒理学动物实验方法，是根据染毒时间长短，可有急性、亚急性和慢性实验三种。此外，还有研究毒物某些特殊作用的实验，如致癌、诱变及致畸试验，以及生化代谢试验、繁殖试验、致敏试验及动物行为障碍试验等。可以采用经口、经呼吸道及经皮等染毒方法，有时为获得基本的毒性资料，也可采用注射(腹腔、静脉、肌肉、皮下等)的方法。染毒途径的选择，应根据实验目的、人体实际接触毒物的方式、毒物的理化性质及其在环境中存在的形态等因素来确定。
急性毒性试验 指一次较大剂量染毒的试验，是毒理实验研究的第一步。一般应采用两种以上动物，一种为啮齿类，另一种为非啮齿类动物，或两种均用啮齿类。通常采用小鼠和大鼠。急性实验主要是测定半数致死量（浓度）、急性阈剂量（浓度），观察急性中毒表现、经皮吸收能力以及对皮肤、粘膜和眼有无局部刺激作用等，以提供受试毒物的急性毒性资料，确定毒作用方式、中毒反应，并为亚急性和慢性毒性试验的观察指标及剂量分组提供参考。
毒物的急性毒性常以半数致死量(LD₅₀)或半数致死浓度(LC50)表示，是指一次染毒后引起半数实验动物死亡的剂量或浓度。LD50或LC50是根据动物实验结果，经统计学方法处理后求得的，不受实验中存在敏感性特别高或耐受性特别大的动物的影响，因而是一个比较稳定和误差较小的毒性指标，多用来比较各种化学物急性毒性的大小，即LD50或LC50的数值愈大，毒性愈小，反之则毒性愈大。
测定LD50或LC50的实验，一般应有5个以上不同剂量的实验组，其中尽可能不包括全部动物都不死亡和全部动物都死亡的剂量组。通常在进行预试后，以能使10%左右动物死亡的剂量为最低剂量，使90%左右动物死亡的剂量为最高剂量，在此范围内安插其他剂量组。各组间距要根据最后计算LD50所用方法的要求来安排。每组动物数不应少于6～10个。
动物染毒后并不总是立即死亡的，根据毒物的毒作用机理不同，有时动物在染毒数日之后才死亡。因此，急性毒性试验中规定了染毒后的观察时间，一般为2周，某些特殊情况下也可适当缩短或延长。
亚急性毒性试验 指多次重复染毒的试验。染毒期限为动物寿命的1/10，啮齿类动物一般进行1～3个月。亚急性毒性试验可视为慢性毒性试验的一个缩影，有时可以代替慢性毒性试验。亚急性毒性试验的目的是：
❶进一步探讨受试毒物的毒作用（包括蓄积作用和习惯性）。
❷确定是否需要进行慢性毒性试验。
❸为慢性毒性试验筛选敏感指标和选择剂量提供资料。
❹初步估计阈剂量（即出现有害作用的最小剂量）和无作用剂量（即阈下剂量或不出现有害作用的最大剂量）。亚急性毒性试验时剂量的选择，应当使动物在试验期间不致很快死亡，而中毒症状却能明显发展，各系统、器官和组织出现一定的功能障碍和病理变化。一般采用1/5～1/20 LD50。
观察指标通常包括：
❶健康状况及生长发育的观察，如动物的一般表现、行为、体重、进食量、食物利用率、中毒症状及死亡情况等。
❷血、尿常规及各种生化检查(血象和肝、肾功能等)。
❸动物的病理学检查以及脏器系数（即脏器重与体重之比）的测定。目前已把血液学、生化学及形态学检查作为亚急性和慢性毒性试验中常规应用的三大类检查。例如，生化学检查包括很多酶系的测定，从而可较深入地了解机体的细微变化。在实验中可根据受试毒物的毒性特点，选择不同的酶系指标，如研究有机磷农药的毒性时可测定血和脑组织中的胆碱酯酶活性。近年来由于组织化学的发展和电子显微镜的应用，已使毒理学研究进入了亚细胞水平和分子生物学水平。
为了评价毒物蓄积毒性的大小，可通过蓄积试验测得蓄积系数。蓄积系数是指分次染毒(次数为n)引起某种效应的总量与一次作用时所得相同效应的剂量之比值。当以死亡为指标时，则蓄积系数(K)可用下式表示：
蓄积系数的值愈大，说明蓄积作用愈弱或蓄积毒性愈小，反之则蓄积毒性愈大。
慢性毒性试验 指长期染毒的试验。染毒期限为动物寿命的大部分或终生，一般为4～6个月或更长。在食品毒理的慢性毒性试验中，因考虑到各种与食品有关的受试物往往是终生摄取的，故试验期限较工业毒理和环境毒理所规定的为长，如小鼠为1 1/2年，大鼠为2年，狗为6年。慢性毒性试验的最大缺点是染毒时间过长，故有的学者提出增加剂量以缩短时间的方法，称为亚慢性毒性试验。慢性毒性试验的主要目的是：
❶确定毒物的慢性阈剂量或阈浓度及无作用剂量。
❷阐明慢性毒性反应，进一步探讨中毒机理。
慢性毒性试验的剂量，可根据急性及亚急性毒性试验中关于该毒物毒性的资料来确定，其中最主要的是考虑该毒物有无蓄积作用，在体内的转化及排泄速度等。一般至少设两个剂量组，其中高剂量组应使受试动物引起明确反应，但剂量又不能太高，否则动物死亡太多，影响对结果的分析。低剂量组应在整个实验期不出现任何有害作用。有条件时可设三、四个剂量组。可以LD50的1/10、1/50、1/100和1/1,000设组。一般情况下，LD50的1/10往往可引起蓄积中毒，1/100～1/50相当于阈剂量，1/1,000则往往为无作用剂量。如果通过亚急性毒性试验对中毒阈剂量和无作用剂量已有初步估计，则可将估计的中毒阈剂量作为最高剂量组，并以其1/3或1/9为最低剂量组，中间插入一、二个中间剂量组。实验至少选用两种动物，一般可按急性毒性试验结果，选择最敏感的动物或选用较年幼的大鼠和兔。大鼠等啮齿类动物每组至少应有20只，雌雄各半。
观察指标基本上与亚急性毒性试验相同。由于试验时间较长，故除在试验开始和结束时分别进行血液学、生化学和形态学检查外，还应在试验期间定期进行，以了解各种指标的动态变化，每次间隔时间可根据具体情况决定。此外，对在试验期间死亡的动物，必须进行病理组织学检查，以确定死亡原因。
动物实验结果的正确解释和应用，尤其外推于人，是一个极为复杂的问题。毒理实验条件尽可能模拟人接触毒物的情况，例如周密设计染毒的途径、剂量、方式，选择合适的实验动物，对各种属动物研究比较毒性，直接观察接触者等，都是解决上述问题的重要途径。但如何更好地将动物实验结果用以估计对人的毒性及作用特点，仍是毒理学需要进一步研究和解决的重要课题。不同种属和品系的动物对毒物敏感性的差异，是动物实验结果外推于人的最大障碍。这种差异除了与动物的解剖、生理、生化的特点和饮食习惯等有关外，主要是与毒物的代谢有关。例如，乐果在体内主要由肝脏的酰胺酶降解，而人体的酰胺酶活性较许多实验动物为低，所以对人的经口毒性较大。
人对多数毒物一般较动物敏感，即人的中毒剂量比动物低。人对生物碱、钡、锌的盐类、甲醇、硝基苯等毒物特别敏感。如果常用的几种啮齿类动物(小鼠、大鼠、豚鼠和兔) 对毒物的敏感性没有明显的种属差异时，一般可以说明人的敏感性亦如此，即可认为该毒物对人和动物的毒性比较接近；如果再参考对肉食动物(猫、狗)或杂食动物（猪）的毒性，则这种估计更为可靠。
在慢性毒性试验中所测得的阈浓度和无作用剂量，是制订毒物在环境中最大容许值的重要依据。但由于动物和人对各种毒物的敏感性不同，动物实验期限与人接触的期限不同等原因，在外推于人时，必须将阈浓度或无作用剂量按安全系数缩小，定为最高容许量(参见“毒物卫生标准”)。
有人推荐根据动物体重与毒性指标所得的直线回归方程，用下列公式来计算外推系数：
式中K为外推系数； 60为人的平均体重，以公斤表示；P为慢性毒性试验中所用动物的体重，以公斤表示； b为回归系数。也有人认为根据动物相对体表面积亦即代谢率的不同来计算更为合适。目前国际上尚无统一的外推标准。