核酸分子杂交技术

核酸(DNA、RNA)分子由许多单核苷酸分子组成。不同核酸的特性由其单核苷酸分子中碱基的排列顺序决定。根据模板学说，DNA分子双链的形成、DNA的复制、以DNA为模板合成RNA（转录）等，都有赖于碱基互补关系，即腺嘌呤与胸腺嘧啶（或尿嘧啶）通过氢键互补配对，鸟嘌呤与胞嘧啶也通过氢键互补配对。如果有两条核酸单链(DNA、DNA或DNA、RNA)，其中一条的碱基顺序适与另一条的碱基依次互补配对，则在一定条件下两者可形成核酸复合体；反之，若两者在碱基顺序上不依次互补，则不形成复合体。这种复合体形成的现象称为核酸的分子杂交，其反应称为核酸分子杂交反应。应用这一反应去检查和说明两种核酸分子碱基排列有无互补关系或互补的程度，则称为核酸分子杂交技术。

DNA和RNA杂交的碱基互补示意图
T为胸腺嘧啶 A为腺嘌呤 C为胞嘧啶 G为鸟嘌
呤U为尿嘧啶

核酸分子杂交技术通常都是微量操作，而且反应系统中至少有两种核酸分子，必须有识别的方法。所以进行核酸分子杂交反应几乎都必需首先制备核素标记的核酸分子，最后凭借放射性测量（稳定核素用其他测量手段）进行判断。
目前，核酸分子杂交技术已广泛应用于分子生物学及分子病理学。如： 检测来自不同种属或不同细胞的核酸间碱基顺序的同一性和差异性； 比较种属演化发展各阶段及个体生长发育各阶段核酸碱基顺序的变化规律； 探讨病理过程中核酸碱基顺序的变化规律及药物治疗的影响；检测宿主细胞内的病毒基因及其定位；研究病毒与肿瘤发生的关系以及遗传工程学上用于检定核酸片段的相关性，判断人工改造基因是否成功等。此外，还可利用核酸分子杂交技术作为分离基因或基因片段的一种手段。核酸分子杂交技术的基本方法 可概括为： 将要观察的两种核酸（均为单链）之一用核素标记，选择合适的反应条件使标记核酸与非标记核酸进行杂交，最后用一定手段将杂交分子 （核酸复合体）与未杂交的标记核酸分开，测复合体的放射性，根据放射性的量判断杂交是否成功或杂交的程度。
(1) 标记核酸的制备：产物的比放射性要高（直接影响灵敏度），而且不影响杂交反应的进行。可以采用的方法有：
❶用³²P-或³H-核苷参入活细胞后提取核酸；
❷用2H-或¹⁴C-硫酸二甲酯制备甲基化RNA;
❸用¹²⁵I标记核酸；
❹用T₄ RNA连接酶将³²P-ATP连接到RNA的3′末端；
❺切口翻译法；
❻以DNA为模板，³H或3²P标记的三磷酸核苷为原料，用RNA聚合酶酶促合成标记互补RNA (cRNA);
❼以RNA为模板，3H或²²P标记的三磷酸脱氧核苷为原料，用逆转录酶酶促合成标记互补DNA (cDNA)。最后两种方法可提高标记核酸的比放射性和杂交反应的专一性。
(2) 最适反应条件的选择： 应用动力学实验选择最佳温度、时间、pH、盐浓度以及两种单链核酸的比例关系。(3) 核酸杂交分子的检测： 可概括为固相法和液相法两大类。
固相法是先将变性DNA(即经热处理后呈单链状态存在的DNA)固定在固体基质上，再与标记RNA或标记DNA进行杂交反应。其好处是可避免变性DNA的自我“退火”（即重新形成双链）。但固相法只适用于部分杂交反应。可用的固相基质有多种，例如将T4 DNA连接于纤维素上，将DNA固定于乙酰磷酸纤维素上，将DNA与琼脂混合做成胶粒等。将上述方法固定的DNA与标记RNA杂交后，高温下用低浓度盐溶液可将互补杂交分子洗脱，最后测定洗脱液的放射性，计算杂交百分数。1965年发展了固相膜方法，操作简便，可同时测定较多样品，故目前应用较广。具体方法：将变性DNA轻度减压抽滤于硝酸纤维微孔薄膜上，然后将膜片浸入含标记RNA的反应液，反应结束后冲洗膜片，用RNA水解酶除去残余的标记RNA，最后测量膜片上的放射性，计算杂交百分数。
液相法是使变性DNA和标记RNA在溶液内自由碰撞进行杂交反应，然后将未杂交的标记RNA除去，亦即反应完毕后需要有分离RNA和杂交分子的步骤。分离方法可归纳为三类：
❶用氯化铯密度梯度离心法将杂交分子与未杂交分子分开；
❷利用硝酸纤维素酯微孔薄膜，这种薄膜只吸附单链DNA和DNA-RNA杂交分子，过滤收集DNA-RNA杂交分子，并用RNA水解酶除去残余的标记RNA;
❸先用核酸水解酶使未杂交的标记核酸降解，再利用某些吸附剂吸附杂交分子及未杂交分子的降解物，用适当的洗脱液将二者分开，例如用甲基化白蛋白硅藻土分离DNA-RNA杂交分子，用羟基磷灰石分离DNA-DNA或DNA-RNA杂交分子。
核酸分子杂交实验方式 根据欲说明的问题不同而选择不同的实验方式。常用者有以下几种：
(1) 动力学实验： 任何一种核酸样品，在进行杂交实验前必须先进行一系列动力学实验，以选择最适反应条件。亦即固定其他条件而改变某一条件，选出最佳点，包括反应温度、反应时间、反应液pH、反应液盐浓度、两种核酸的比例等。
(2) 饱和杂交实验： 在含有一定量非标记核酸分子的反应液中，加不同量的标记核酸分子。反应结果，杂交分子的放射性随标记核酸的增加而提高，最后达到饱和。本方法主要用于对两种核酸分子是否有互补配对关系作定性。如果有互补配对关系，标记核酸不需加很多就可达到饱和。
(3) 竞争抑制实验： 这种方法可以比较不同核酸与某一特定核酸间碱基顺序相关的程度，有定量的作用，医学上应用较多。设欲检验不同RNA与某一特定DNA的互补关系，先以该DNA为模板，酶促制备与之呈完全碱基互补配对的标记RNA^*。然后在各反应管中加一定量的变性DNA，一定量的RNA^*以及不同量的被测RNA、反应结束后测杂交分子的放射性。被测RNA与该DNA的互补配对程度越高，则竞争抑制作用越强，杂交分子放射性越低。也可采用“预饱和”的办法，即变性DNA先与被测RNA饱和杂交，再与RNA^*进行第二次杂交，杂交分子的放射性也与被测RNA的互补配对程度成反比。
(4)原位分子杂交：将细胞固定于载玻片上，使DNA原位变性，再与标记核酸进行原位杂交反应。反应后用放射自显影术观察杂交分子在细胞内的分布和定位。超薄切片原位杂交还可在超微结构水平探讨复制和转录。此外，若以专一的mRNA为模板制备标记cDNA(互补DNA)，与染色体进行原位杂交，不但可观察cDNA在染色体上的分布，而且可在染色体上进行基因定位。
除上述几种实验方式外，还有不少方式。如耗尽实验或多步杂交反应可用于纯化某种RNA；复性动力学实验可通过复性动力学曲线反映DNA的基本特性；菌落杂交技术可用来分离含专一基因的杂交质粒或基团等。这些方法在分子生物学和遗传工程学中都是有用的技术。