扫描电子显微镜检术scanning electronmicroscopy

利用扫描电子显微镜 （简称扫描电镜） 对样品微细结构的形态、大小和分布进行观察的现代科学研究手段。扫描电镜具有分辨率高、放大倍数可变范围大、观察视场大、景深长等特点，所以图像立体感强、样品适应性大以及样品受辐射损伤小。在生物学、医学、农业科学及非生物科学领域中都得到广泛的应用。若加上特殊的附件，成为分析电子显微镜，就不仅能够获得样品形态结构信息，而且能用来分析样品的化学组成。
扫描电镜基本结构 由电子光学系统、真空系统、图像信号检测器、图像显示与记录系统、电源系统及其他附属部件组成。
电子光学系统 即镜筒，由电子枪、合轴线图、聚光镜、物镜、电子束偏转线圈、消像散器及样品室等组成。各部件用橡胶圈连接并密封在一个金属圆筒中，以遮断外部磁场的干扰。聚光镜和物镜都是电磁透镜，它将电子枪发射的电子束聚集成直径仅为几毫微米的电子探针，后者轰击样品并在其表面作扫描运动，产生图像的电信号。
真空系统 见透射电子显微镜检术。
图像信号检测器 扫描电镜根据所检测的信号不同，可分别安装二次电子检测器、反射电子检测器、阴极荧光检测器、透射电子检测器等。常用的二次电子检测器主要由闪烁体、导光管、光电倍增管组成。闪烁体为一玻璃片，表面涂以荧光粉和铝膜，在铝膜上加高压时，吸引来自样品的二次发射电子，电子轰击荧光层，图像的电信号转变成光信号。光信号经导光管由光电倍增管放大转变成电压讯号后，输入图像显示器。
图像显示与记录系统 包括图像信号放大器、扫描信号发生器、观察及照相记录显像管。图像信号放大器将信号检测器输出的电压信号进一步放大，推动显像管工作。扫描信号发生器产生锯齿波电流，供镜筒和显像管上的偏转线圈，使照明电子束和显像管电子束同步扫描偏转。当显像管电子束偏转幅度不变时，改变照明电子束偏转幅度，即可改变图像放大倍数。观察和照相分别采用长余辉和超短余辉显像管。
电源系统 基本类似透射电镜，仅加速电压较低，一般为1～30kV。
其他附属部件 为提高电镜的性能，便于操作和扩大应用范围，设置扫描速度变换、曝光定时、照片编号、反差与亮度调节附件，有的还装有冷冻或加热的样品台，拉伸机构等。
扫描电镜的工作原理 镜筒达到高真空后，由电子枪发射照明电子束，后者在合轴线圈调节下与聚光镜、物镜合轴，经聚光镜会聚后，在电子束偏转线圈作用下作x、y方向有规律的扫描运动，再由物镜聚焦射向样品，与样品相互作用，使样品发射二次电子，二次电子的数量决定于样品表面形貌。检测器按扫描顺序收集并初步放大图像信号，由显示器作进一步放大，该信号控制显像管的栅极电位，以调制显像管屏幕亮度。由于显像管和镜筒中偏转线圈的电流由同一信号发生器产生，严格同步，故检测器检测到的图像信号在显像管荧光屏上逐点对应，从而显示出样品表面形貌的图像（见图）。

扫描电镜工作原理示意图

扫描电镜的成像原理 黑白图像可以分解成明暗程度不同的亮点，即像素，像素愈多，图像愈清晰。扫描电镜采用图像分解法成像，即电子束在样品表面按扫描顺序逐点轰击，产生图像信号，经接收器和显示器逐点转变成图像上明暗不同的像素，从而组成扫描电镜图像。电子束在样品表面由点成行、由行成面的逐点轰击，这一过程称为扫描，扫描电镜由此而得名。
图像像素的明暗亮度的差异（反差）取决于样品各点在电子束轰击下，产生二次电子的数量，后者又主要取决于样品表面凹凸情况和样品元素的原子序的高低。二次电子的数量是样品表面特征和入射角的函数，样品表面越倾斜，入射角越大，二次电子数量就越多，称倾斜角效应。因此，由二次电子信号组成的扫描图像反映了样品表面形貌。立体感强的图像除必须具备适中的反差外，还要有一定的辉度、灰度和清晰度。辉度衡量图像亮暗的程度，灰度是影像可区分灰色层次的多少，灰度等级多时，从亮到暗的过渡比较迟缓，影柔和，能反映的细节较多，清晰度亦高。
扫描电镜样品的制备 过程较为简单，有些可以不加任何处理或稍加处理即可进行观察。但对含水较多的生物样品仍需经过取样→清洗→固定→清洗→脱水→置换→干燥→喷镀等步骤。制样过程中清洗、固定及脱水类似于透射电镜制样方法，主要不同处是如何获得观察面、样品干燥方法和表面金属喷镀。
观察表面的获得 扫描电镜主要是观察样品的表面形貌，对于生物体外表面比较容易获得，但有些表面必须根据其粘着物的性质，采取相应的方法彻底清洗，例如吹气、蒸馏水冲洗、超声波清洗、静电吹尘、有机溶剂或酶处理，以至酸碱腐蚀等，以除去表面杂质，暴露真实表面，避免图象产生假象。对于腔性、管形器官的内表面或实质性器官的断裂面，则必须借助冷冻割断法、苯乙烯树脂割断法等来获得。冷冻法是利用致冷剂使组织快速冷冻，然后根据需要的观察面进行劈裂。树脂法是利用树脂浸透组织，经聚合后进行断裂，暴露观察面，再脱去树脂。管形器官还可用铸型法获得复型。
干燥 生物样品需要脱水，以免在电镜真空中失水变形。透射电镜的样品脱水后组织细胞间隙由包埋剂充填，以保持其原来面貌，但扫描电镜的样品表面若被包埋剂覆盖，就不能观察其真实的表面。然而没有包埋剂充填，样品在脱水时细胞易受水的表面张力作用影响而变形，所以必须采用特殊的干燥方法，如空气干燥法、真空干燥法、冷冻干燥法、莰烯干燥法以及临界点干燥法。以后者效果最好。临界点干燥法的原理是利用工作介质（常用液态二氧化碳）在临界状态(二氧化碳临界温度为31.5℃，临界压力为72.8kg/cm2)时，液体表面张力为零，此时使样品干燥，免受表面张力作用，保持样品原来面貌。该法是在样品进行梯度脱水后，用醋酸戊酯置换脱水剂后，再在临界点干燥仪中进行干燥。
表面金属喷镀 电子束轰击样品产生二次电子的数量与样品元素的原子序数有关，原子序数高，产生二次电子数量多。生物样品多数为轻元素组成，二次发射率低。同时生物样品导电率低，电子束轰击时又会使表面积累电荷，产生充放电现象，结果图象异常。故在样品干燥、装在样品台上后，必须进行表面金属喷镀，使样品表面镀一层厚约10～20nm的重金属(金、铂、钯等)膜。表面镀膜方法有真空蒸发镀膜法和离子溅射法。前者是利用高真空镀膜仪使金属达到熔化状态，蒸发的金属粒子射向样品表面，形成一连续的金属膜； 后者是利用离子溅射仪在低真空状态，在一对电极上施以高压时，产生辉光放电，使气体(空气、氮气或氩气)电离，由阳离子轰击阴极金属靶，将靶金属分子溅射出来，并以漫散射方式射向安放在正极上的样品，使样品表面形成均匀连续的金属膜。它与真空喷镀相比较，效果较好，但样品易受损伤。
与透射电镜及光学显微镜的比较 见表。

各种显微镜性能比较

种类 性能	光学显微镜 (OM)	透 射 电 镜 (TEM)	扫 描 电 镜 (SEM)
分辨率 简易型 普及型 高级型	5μm 0.2μm 0.1μm	10nm 1nm 0.1～0.2nm	0.2μm 10nm 3nm
景 深	小，500倍时为2μm	中，500倍时为500μm	大，500倍为1 000μm
工 作 型 式	透射、反射、衍射及其他	主要有透射、衍射	有各种型式和多种功能
样品 制样技术 种类 厚度 大小 状态	容易 多 厚 适应性大 空气中	复杂，需要熟练的技术 薄膜或复型膜 极薄 适应性小 真空中	一般较容易 多 中等 适应性大 真空中
视 野	大	小	大
色 彩	有	无	无
辐射损伤及污染	无	大	较小