基因的拼接

DNA重组技术的基础是基因的体外剪切和基因片段与载体DNA之间的拼接重组。剪切基因主要应用的是限制性核酸内切酶的剪切方法。经体外剪切和分离，所获得的基因片段必须连接到适合的载体DNA分子上，才能有效地转入宿主细胞中进行扩增和表达。载体DNA为双链DNA，含有DNA复制起始点，可在宿主细胞内复制。载体DNA分子上有适宜的限制性核酸内切酶位点，专供外源基因的插入。图1简扼介绍基因和载体DNA的体外拼接的典型过程。
基因片段和载体用同一种限制性核酸内切酶(EcoR Ⅰ)切开，产生相同结构的粘性末端，它们藉5′末端单链的互补作用靠氢键粘合，再由连接酶通过共价键连接末端，形成重组分子。这样的重组分子进入宿主细胞可进行自身复制。若外源基因与合适的启动子接在一起，它就可以被表达。下面将重点介绍DNA连接酶以及多种可行、有效的基因体外拼接方法。

图1 外源基因与载体DNA重组示意图

图2 DNA连接酶的作用机制
E-AMP是酶和AMP的复合物，在带有3′-OH和5′-磷酸基团的缺口处，AMP与5′-磷酸基团结合，再与邻近核苷酸3′-OH连接产生新的磷酸二酯键，将缺口封闭。

DNA连接酶 DNA片段之间的连接主要靠连接酶的酶促反应完成。1967年已从噬菌体感染的大肠杆菌或者未感染的大肠杆菌中发现了多核苷酸连接酶，并将它们分别提取和纯化。继而，在酵母、植物和许多哺乳动物细胞中发现此类酶。在基因工程中，使用最多并已有商品供应的是T₄DNA连接酶，它是从噬菌体T4感染的大肠杆菌中分离而得的。另一种则直接从未经噬菌体感染的大肠杆菌中纯化，称为大肠杆菌DNA连接酶。这两种来源的连接酶催化DNA连接作用是类似的，它们能把双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸之间断开的磷酸双酯键重新闭合。这是由于酶能催化缺口处相邻核苷酸末端3′-OH和5′-磷酸基团之间的共价键连接，重新形成3′,5′磷酸双酯键(图2)。
❶这两种来源的连接酶都要以双链DNA为底物，将双链DNA中每根单链上的缺口封闭，但不能将两条单链DNA互相连接一起。
❷上述缺口是指DNA链上相邻两核苷酸之间磷酸双酯键的断裂，但不能有核苷酸的缺失。
❸酶能将核苷酸的5′-磷酸单酯与相邻核苷酸的3′-OH基团形成共价键。但DNA链中相邻两核苷酸的5′-OH基团和3′-磷酸单酯就不起作用。
❹酶的催化反应需要辅因子的存在，而两种酶的辅因子并不相同。T4DNA连接酶需腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)，而大肠杆菌DNA连接酶需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD，辅酶Ⅰ)。 辅因子先和酶结合， 形成酶和AMP的复合物(E-AMP)。复合物再与DNA链缺口处5′-磷酸基团结合，并把AMP转移其上，游离出酶蛋白，最后5′位上复合基团与3′-OH相作用形成磷酸二酯键并释放出AMP。
连接酶在基因工程中的主要作用是DNA片段之间的重组连接，其合适底物为具有相同互补单链粘性末端的DNA片段。但带有平末端的DNA片段也可用T4DNA连接酶催化连接，这种连接称为齐头连接或端接。端接的连接效率不如粘性末端间的连接（简称粘接）。但它的可行却大大增加了DNA重组技术的灵活性。由于大肠杆菌DNA连接酶不能进行端接，因此T4DNA连接酶是目前基因工程中最常用的连接酶。
在进行DNA重组时，一般希望两种来源DNA片段间一对一连接，不希望片段自身的成串连接，这就需要选择适宜的反应条件，其中起决定性作用的是底物浓度和不同片段间的最佳比例。另外，虽然连接酶的最佳反应温度是37℃，可是在DNA的体外重组反应中，经常采用较低温度(12～16℃)下的长时间连接(12～24小时)，目的是为了保全片段粘性末端之间的氢键连接，提供酶反应的适宜底物条件。
基因拼接方法 两种不同的DNA用同一种产生粘性末端的限制性核酸内切酶切割，那么这两种DNA片段间的互相连接将是典型而有效的DNA连接方法，如图1所示。为此，有时可人为地使要连接的两种DNA持有相同的粘性末端以利拼接。迄今为止许多实验采用了这样的连接方法，但这不是唯一的基因拼接方法。随着限制性核酸内切酶的不断发现、DNA人工合成技术的应用，以及DNA重组技术进一步发展，对基因的拼接，即DNA的重组方法也越来越多。下面介绍几种常见的方法。
1. 提供相同粘性末端的DNA片段。最简便的是用同一种限制性核酸内切酶剪切基因和载体，但有时该酶在所需基因上有几个切点，即将完整基因切成两段或几段，而无法把整个长度基因插入载体。此时可选用另一种可产生相同粘性末端、但特异性不同的限制酶进行切割。例如，

以上6种酶虽然识别序列不相同，但切割后产生的末端相同，均为带GATC四核苷酸单链的5′粘性末端，它们均可借氢键互补粘合(图3)。
2. 用人工合成的寡核苷酸提供相同粘性末端。由于核酸化学合成技术的发展，已能方便地人工合成含有限制性核酸内切酶识别序列的寡核苷酸片段。它是按照限制性核酸内切酶特有的双轴对称性识别序列合成的单链片段，两单链片段可借氢键粘合成双链，其末端是平头的。此片段在适宜的条件下可借氢键互补相连成双链的形式。像这种能粘合成具有回文型双链结构的单链寡核苷酸称为连接子（接头）。例如图4所示的EcoR Ⅰ连接子(CCGAATTCGG单链+核苷酸)。其用途是在DNA片段末端创建一个特定的限制性核酸内切酶粘性末端，以便与持相同粘性末端的载体重组。

图3 具有相同粘性末端结构不同特异性酶解的片段间连接

采用人工合成的寡核苷酸片段不仅可给DNA片段提供实验所需要的粘性末端，而且还可以把两种不同结构的末端的片段连接起来。图5介绍了此种实例： 通过人工合成一个特定序列的八核苷酸(pGATCTGCAOH)将分别持BglⅡ和PstⅠ末端的两个片段连接在一起。

图4 人工连接子的应用人工合成寡核苷酸

图5 不同末端结构片段间的连接

3. DNA片段的平末端连接。有的限制性核酸内切酶(HaeⅢ、SmaⅠ、HincⅡ等)降解DNA之后，产物片段末端是齐头的，没有突出的单链，也称平末端。T4DNA连接酶可以将带平末端的DNA片段互相连接，但效率远不如粘性末端间的连接。连接反应需要高底物浓度，也需要提高酶浓度。平末端片段间连接成功，使实验者不必考虑粘性末端的特异结构，这样片段间重组更为灵活。但是大肠杆菌DNA连接酶不具有平末端片段间的连接活力。
要获得DNA片段的平末端，除了选用产生平末端的限制性核酸内切酶外，可以人工地把片段末端的核苷酸单链削去，改造成平末端。核酸酶S1是一个专一降解单链DNA或RNA的核酸水解酶，是用于削去双链DNA中单链末端的工具酶(图6)。
大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段又称Klenow片段，是由全酶即大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ经枯草杆菌素处理后得到的肽链片段。此片段仍然保持有全酶的聚合酶活力和3′→5′的外切酶活力，但丢失了5′→3′的外切酶活力。因此，对于5′单链突出末端，它能借聚合酶活力把相应的3′端延伸补齐；对于3′单链突出末端，则聚合酶活力不起作用，而3′→5′外切酶显示活力把3′端的突出单链削平。所以不论是3′或5′端突出的单链末端，经Klenow片段作用后均成为平末端(图7)。

图8 DNA片段的末端加尾后的拼接

目前Klenow片段是最常见的用来处理DNA片段末端使产生平末端的工具酶，即使用S₁核酸酶处理的末端也少不了用Klenow反应一下，以保证两端的齐头结构。
4. 片段末端的接尾。除了靠连接酶把双链DNA片段相互连接之外，有人用片段末端的互补均聚体尾巴的氢键粘合来连接DNA(图8)。将带均聚体的DNA片段退火，藉尾巴上均聚体间的氢键把两种片段连接。这种没有共价键连接仅靠氢键粘连的重组分子可以转化到宿主体内，并在宿主体内再完成其共价键连接成为完整的分子。
在基因与载体连接时，要考虑到连接的方向性，上面介绍的几种连接方法均非定向连接，即基因插入到载体上有正、反两个方向。这两种方向性连接对于基因在宿主细胞内扩增没有影响，但是在研究基因表达时，把基因片段组建在载体所带启动子的合适部位时，基因片段连接方向就很重要。只有正确的方向加上合适的密码阅读框架，基因才会被正确地表达。这样往往需要定向连接和调整密码阅读框架。采用两种不同特异性的限制性核酸内切酶同时切割基因和载体，或者是采用一端粘接另一端齐头连接，都可以做到定向连接。总之，基因和载体连接的方法很多，实验者应按照自己的要求选择合适的方法。