基因的剪切与限制性核酸内切酶

生物体的各种基因均有序地排列于细胞的染色体DNA中，要分离出特定基因就必须打断染色体DNA链。因此在基因工程中，基因剪切是进行基因拼接重组的第一个步骤。基因剪切可以用物理、机械的方法，也可以采用生化的酶促降解方法。DNA是以四种脱氧核糖核苷酸(A、G、C、T)以3′至5′磷酸双酯键连接而成的分子量很大的聚合体。最简单的病毒DNA如乙型肝炎病毒的DNA链约有3200bp，猕猴病毒 (SV40)有5243bp，腺病毒DNA有35,000bp，稍大一些的有噬菌体DNA，有几万至十几万个碱基对，大肠杆菌为2.6×106bp，哺乳动物细胞染色体DNA为2.9×109bp。它们与蛋白质结合后形成相当稳定的结构，但当除去蛋白质，特定的二、三级结构便不能维持，过大的分子则易受机械和物理因素影响而发生断裂。将DNA制剂挤压通过注射器的细针头或者经超声波处理，就会断裂成不同大小片段。控制处理条件便可得到一定大小范围的片段，进一步作蔗糖密度梯度离心或者电泳可将断裂DNA分级，而获得一定分子量范围的基因片段供基因克隆用，譬如构建基因库。一般说来这种方法是随机剪切。剪切基因的主要手段是限制性核酸内切酶的酶促降解法。因此这里将着重介绍基因剪切工具——限制性核酸内切酶及其在基因工程中的主要应用。
限制性核酸内切酶简称限制酶，是一类识别双链DNA中特定核苷酸序列的脱氧核糖核酸水解酶，主要存在于微生物中。早在50年代就提出，噬菌体侵染时宿主细胞表现出限制修饰现象。所谓限制修饰现象即是一种噬菌体能在细菌的某一株系中复制繁殖，分离后此种噬菌体可再感染同一株细菌，并有很高感染率，但此种噬菌体对同种宿主的另一新株系细菌则几乎不能感染，仅有少数的能在新株系的细菌中存活。凡是能存活下来的噬菌体，可以分离后再感染已适应的新菌株，并很好地繁殖下去。瑞士W. Arber教授等自1960年起从事关于λ噬菌体的宿主限制修饰现象的分子基础的研究。他们指出，宿主控制的限制现象表现为噬菌体DNA被降解，这种降解作用是由于细菌体内具有水解DNA的核酸水解酶所致。由于这种酶对DNA的降解是有限制性的，只能水解特定核苷酸序列的DNA双链，并有一定切点，故称限制性核酸内切酶。此外，他们还提出，这种酶并不降解宿主自身的内源性DNA，原因是宿主细胞内同时存在着与相应限制性核酸内切酶相同识别序列的甲基化酶，它能使内源性DNA藉甲基化作用而被修饰。Arber和他的同事们曾从大肠杆菌B株中分离到DNA的甲基化酶，1968年又从同种菌株中部分纯化得到限制性核酸内切酶。但是他们所分离到的内切酶裂解DNA链的位置离识别序列较远，而且切点杂乱，不在一个特定位点，因此不适合于基因体外重组研究的工具。
美国约翰·霍普金斯大学的H.O.Smith)及其同工从流感嗜血杆菌(Hemophilus influenzae)d株中分离到一个需识别特定核苷酸序列而切点专一的限制酶称之 HindⅡ，并证实了HindⅡ的识别特异性及酶的切点：

自1971年始，美国约翰·霍普金斯大学的另一位教授D.Nathans及其同事应用HindⅡ研究了SV₄₀ DNA的酶切降解作用，排出Hind Ⅱ的酶切图谱，并成功地确定了SV₄₀DNA的复制起点，成为第一个应用限制性核酸内切酶研究基因结构和调控的科学家。从此限制酶成了基因工程中剪切基因的主要工具。
据美国冷泉港生物实验室的Roberts教授统计，到目前为止已从500多种细菌及微生物中发现限制性核酸内切酶，有的可以同时存在四种不同特异性的限制性核酸内切酶。若按酶的识别特异性来分，共有100多种。
1. 命名： 为了统一起见，Nathans和Smith提出了命名限制性核酸内切酶的规则，即限制性核酸内切酶的名字从相应微生物的拉丁文名中摘取，由其属名的第一字母（大写）和种名的第一、二两字母（小写）组成，若有第四个字母则来自株系，最后的大写罗马数字表示同一细菌中存在的几种不同特异性的酶，例如HindⅡ就来自：

按此规则命名，如遇到两种不同来源的酶具有相同命名时，则第三个英文字母可以有一定灵活性，例如XmnI和XmaI的命名：

2. 分类：所有的限制性核酸内切酶识别的核苷酸序列至少是四核苷酸，同时所有的限制酶需要以二价镁离子作辅因子。然而按照各种酶对其他辅因子的需要与否，以及它们切割DNA链的特点，可将已发现的酶分为三种类型，即Ⅰ型酶、Ⅱ型酶和Ⅲ型酶。所谓Ⅰ型酶是指需要ATP和S-腺苷甲硫氨酸参加反应的一类限制性核酸内切酶，它们切割DNA链的位置远离于识别序列(大约在相距100～1000bp范围内)，而且无特定位点。例如EcoB酶。由于这一类酶断裂DNA链无特定位点，因此在基因工程中无应用价值。Ⅲ型酶也需要辅因子、ATP参与反应，它们在识别序列后的25～27bp范围内切断DNA，且切割位点是特定的。例如EcopI、EcoP15、HindFⅢ等等。在基因工程中这类酶可作为工具酶。
至今所发现的限制性核酸内切酶中，大部分属于Ⅱ型酶。Ⅱ型酶是指那些反应时不需要除镁离子外的其他辅因子的限制酶。这类酶有特定的切割位点，位点可以在识别序列内或靠近识别序列，但这种酶只有一种切割位点，因此Ⅱ型酶是基因工程中有用的剪切DNA工具酶。3. 酶的识别特异性： 限制性核酸内切酶与DNaseI等DNA水解酶所不同的是限制性核酸内切酶具有识别D-NA序列的特性，即酶选择性地切割DNA的特定序列。例如常用的酶EcoRI其识别序列为：

在双链DNA中，凡是出现这样的核苷酸顺序时，ECoRI就可在箭头所指处将此序列切开。图示序列显示酶所识别的核苷酸序列在结构上具有180°旋转对称性，或称回文型序列。绝大部分限制酶的识别序列均有此回文型序列，下面列出几种：

从所列识别顺序中可见，有些酶如Mbo Ⅱ识别核苷酸顺序并不是回文型结构，这样的酶其切割位点一般都不在识别序列之中，而在它不远处的下游区。限制性核酸内切酶中具有相同特异性，而来源不同的酶称之同切限制酶。在DNA链中四核苷酸识别序列出现的概率要高于五、六核苷酸，对于随机排列的DNA链中四核苷酸顺序出现频率为11256，即平均每256bp就会出现一个顺序，而五、六核苷酸顺序频率则分别为1/1024和1/4096，这也就是说识别序列短，酶特异性就低，DNA被切割成较短片段。相反六核苷酸识别特异性的酶在DNA链中切点少，所切出片段数目少而片段长，特异性就高。目前发现的特异性最高的酶是识别八核苷酸顺序的SfiⅠ和NotⅠ两种酶，它们在DNA链中的出现频率大约为1/65,536，所切DNA片段相当大。
4. 酶的切割位点及片段末端的结构：各种酶切割DNA双链后产生的末端有两种，一种是平末端，如Hae Ⅲ等所产生的末端是齐头的；另一种是粘性末端，如EcoRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ、PstⅠ等酶所产生的，在末端前有一个2～4核苷酸长度的单链，此单链如可突出于5′端，为5′粘性末端，如为3′突出，称为3′粘性末端。该单链核苷酸与同一酶产生的另一片段末端的单链是互补的，可藉氢键相连，而且为T4DNA连接酶相连接。末端的这种结构特点进一步确立了限制性核酸内切酶是DNA体外重组的有用工具酶。

微生物限制修饰体系中对DNA起修饰作用的是甲基化酶。甲基化酶能把S-腺苷甲硫氨酸中甲基转移到核苷酸的腺嘌呤或胞嘧啶环上，分别形成N⁶-甲基腺嘌呤或5-甲基胞嘧啶。这类甲基化酶的特点是酶具有识别特异性。一般说一种特异的限制性核酸内切酶均有其相应的，即具有相同识别特异性的甲基化酶存在，它们使限制酶识别的核苷酸序列中的A或C甲基化，从而抗阻了限制性核酸内切酶的降解作用。例如：

因此当限制性核酸内切酶的识别序列被甲基化，其活力便丧失。一般来说，一种限制性核酸内切酶活力只受其相应的甲基化酶的影响。例如HpaⅡ和MspⅠ是同切限制酶，虽然它们识别相同的核苷酸序列(CCGG)，但是它们相应的甲基化酶却使识别序列中不同位置的C碱基甲基化，结果HpaⅡ活力只被HpaⅡ甲基化酶所抑制，而MspⅠ甲基化酶则并无影响。应用甲基化酶抑制限制性核酸内切酶的作用也是基因工程中拼接DNA片段所选用的技术之一。

另外，分子克隆实验常选用大肠杆菌为寄主细胞，不少大肠杆菌突变株保留着野生型所持有的dam或dcm基因。dam是使脱氧腺嘌呤甲基化的基因，能使DNA链中GATC序列的腺嘌呤N6位甲基化。在dam+的大肠杆菌中所抽提的DNA，其中GATC中的A已甲基化了，使有些酶如MboⅠ、BclⅠ、ClaⅠ的活力受影响，而另一些如BamHⅠ、BglⅡ、PruⅠ、San SAⅠ、Xho Ⅱ不受影响。与此相反，DpnⅠ却只对甲基化的GA*TC顺序才起作用。因此，在进行DNA重组时，必须正确选用适当的工具酶。
限制性核酸内切酶除了作为基因工程中剪切DNA的有用工具外，还具有更广泛的用途，例如绘制基因的物理图谱，测定基因的核苷酸顺序，通过限制性核酸内切酶谱的多态性测定了解基因的突变或用于遗传性疾病的基因诊断。总之，限制性核酸内切酶及其相应的甲基化酶是DNA重组技术，也是基因分子生物学与分子遗传学理论研究中的有用工具。