基因的人工合成

在基因工程中，被克隆和表达研究的外源基因，可以由mRNA经反转录酶酶促合成的cDNA提供，也可以从染色体DNA上分离得到。后者是先把染色体DNA借鸟枪法或基因库技术组建成一系列克隆，再通过克隆的筛选来找到所需的基因(参见“基因库”、“cDNA库”)。此外，还有一条直接提供外源基因的途径，就是人工合成，这是当前很有发展前途的方法。为了获得人工合成的基因，首先要分析基因的结构与核苷酸序列，提供合成基因所需要的全部信息； 然后，需要一整套行之有效的合成DNA片段的技术。Maxam和Gilbert的DNA化学测序法和Sanger等的链末端终止法能确切地测得基因的核苷酸序列。多肽链的氨基酸序列分析技术的发展，也为其基因结构及核苷酸序列提供有用信息。近年来DNA化学合成技术有了突破性发展，更保证基因的人工合成得以实现。
所谓DNA的化学合成，简单地说，是借化学反应，把一脱氧核苷的3′-位OH与另一脱氧核苷的5′-OH用一磷酸二酯键共价结合起来。为了保证这种共价结合确切地发生在上述指定的两基团之间，须把两核苷的其他功能性基团进行保护性封闭，并且在合成反应完成之后又能有效地去除所有保护性基团，恢复人工合成的核苷酸的天然结构，因而，DNA的化学合成变得复杂和难度较大。Khorana及其实验室为此作出了很大贡献，他们早在70年代初，首次成功地合成了有生物功能的DNA片段。早期，DNA化学合成反应在溶液中进行，每步反应之后，底物与反应产物间的分离步骤繁琐而又费时。自从把合成反应固相化之后，只要通过简单的洗脱，即可把底物彻底除去，而产物留于固相支持物上，以进行下个核苷酸的加合。常用的固相支持物为硅胶颗粒、纤维素和聚丙烯酰胺凝胶颗粒。80年代诞生了DNA合成仪，使DNA片段的化学合成实现了机械化和自动化，有力地推动了基因的人工合成。
DNA的化学合成方法 可有三种方法：磷酸三酯、亚磷酸三酯和亚磷酰胺方法。合成反应均在固相支持物上进行。先把合成的第一个核苷酸以核苷形式固定于固相支持物（例如硅胶颗粒）上 (见图1化合物(1))。然后在含有核苷酸化合物溶液中进行反应。不同的方法所用核苷酸化合物不相同 (见图1化合物(2),(3),(4))。缩合反应后，核苷酸被连于固相核苷的5′-OH位上，多余的核苷酸化合物可被洗去，连在固相支持物核苷上的核苷酸又提供了5′位上-OH (见图1化合物5)，继续接受第三个核苷酸。

图1 DNA化学合成的各种化合物

亚磷酸酰胺法是最新采用的化学合成法，即把亚磷酸三酯法所用的化合物(3)中的氯原子，用二烷基氨基或二异丙基氨基取代，从而使化合物非常稳定。在偶联反应时，化合物先用四唑激活。图2介绍了亚磷酸酰胺法合成DNA的基本流程，每一次循环的完成，增加一个核苷酸。要合成二十核苷酸片段需经过19次循环。本法的优点是所用化合物比较稳定，反应产率高，每步可在96%以上，甚至可高至98～99%，而且无副反应。采用本法可合成的片段长度长达五十核苷酸，有人还尝试能合成100碱基长度的片段。

图2 亚磷酸酰胺法合成DNA流程图

DNA合成仪 DNA合成是一种循环式的重复过程，每一次循环使片段增加一个核苷酸。鉴于循环式合成流程以及它可被固相化的特性，人们设计出一种专门的仪器，使DNA的化学合成机械化和自动化，这类仪器称DNA合成仪。合成过程用电子计算机控制，只要实验者输入需合成的核苷酸顺序，仪器即可按指令自动合成，每20分钟左右即完成一次循环，增长一个残基。一台仪器可同时进行三四个不同序列的片段合成。高效率、自动化的仪器使基因的人工合成得以实现。
基因的合成步骤 DNA片段合成的化学反应效率可高至96%以上，有的高达98～99%。在短片段 （二十至三十核苷酸）的合成中，产率是理想的，过长的片段，超过五十核苷酸长度时，产率就降低。所以DNA化学合成时，DNA片段长度有一定的限制。因此，采用人工方法合成完整的基因时，要把基因拆成小的片段(例15～30核苷酸长度)，分别合成，然后再借T4DNA连接酶按次序拼接一起。为了便于用连接酶拼接，在人为拆成各个片段时，要考虑提供拼接用的粘性末端。图3的干扰素基因合成的设计方案示意了基因合成的基本步骤。
1. 按照已知的DNA序列，先划分几个大段，直至最后细分成15～30残基长度的单链片段，并依次编号，便于片段的有序拼接。
2. 用合成仪逐一合成每一单链片段，并使片段5′端磷酸化而3′端保留游离羟基(—OH)。
3. 把每一小片段逐一拼接成50～100碱基长度的较大片段，最后把较大片段拼接成完整的基因片段。
4. 合成的基因片段要提供5′端ATG起始位点，甚至启动子以及和核糖体结合的必需序列。而在3′端要有终止序列。
5. 由于基因要插入载体中，因此要在基因片段的两端提供合适的限制性核酸内切酶粘性末端。

图3 干扰素基因人工合成示意图

人工合成基因在基因工程中的应用 生长激素释放抑制因子是哺乳动物的多肽激素，Itakura等首次应用化学合成的生长激素释放抑制因子基因在大肠杆菌中表达成功。多肽产物在大肠杆菌中降解很快，不能直接分离纯化到足够量的激素。然而，把合成的基因插入到β半乳糖苷酶结构基因的3′端，表达产物是既含β半乳糖苷酶肽链又有生长激素释放抑制因子肽链的融合蛋白。它在大肠杆菌中不易被分解，因而可分离到足够量蛋白。然后，在体外借溴化氢处理，把融合蛋白中两种肽链结合处的甲硫氨酸肽链断裂，以得到完整的有生物活性的生长激素释放抑制因子肽链。
胰岛素的基因工程也是采用了化学合成的基因在大肠杆菌克隆体系中得到成功的。其A肽链的基因是分六段分别合成的，再拼接成完整基因，将基因连于β半乳糖苷酶基因的3′端，借乳糖操纵子中启动子得到表达： B链基因分左右两半，各以六个化学合成片段拼接而成，分别克隆于pBR322中，扩增后的两半基因再拼接成完整的链，接在β半乳糖苷酶基因之后以融合蛋白形式表达。最后，两种融合蛋白分别用溴化氢处理，释放出游离的胰岛素A链和B链，两链再经一SH氧化，形成二硫桥，便可得到具有生物活性的胰岛素。
采用人生长激素的cDNA，在大肠杆菌克隆体系中，只能表达出无活性的激素前体。根据酶谱分析，在人生长激素结构基因中有一个Hae Ⅲ限制性核酸内切酶位点，它定位在密码激素肽链N-端第24氨基酸残基部位的DNA序列上。有人用Hae Ⅲ切割人生长激素的cDNA链，去除密码第24氨基酸残基之前的DNA序列。同时，按成熟的激素肽链1～24氨基酸序列合成了一个长度为84核苷酸残基的基因片段，修饰了原有cDNA序列，以此化学合成的片段和Hae′Ⅲ切割后余下的cDNA主要部分拼接重组，结果表达出有活性的成熟的激素。基因的人工合成技术对于氨基酸残基数目不多的多肽激素基因是行之有效的。除了它能确切提供所需基因片段之外，还具有以下一些优点：
❶提供优先选择的密码序列。不同的生物体，尤其是原核与真核生物之间，氨基酸列。 不同的生物体，尤其是原核与真核生物之间，氨基酸三联体密码被选用的频率是不一致的， 采用人工合成的基因，可按克隆体系的需要，提供最佳三联体密码，保证了基因的有效表达。
❷可方便地提供必要的调控序列。
❸按人的意愿，改变基因中某序列，以表达更有效的蛋白产物。即人工合成基因的技术为蛋白质工程提供了有力工具。
❹有利于从理论上阐明基因表达及其调控的分子机制。总之，人工合成基因的技术推动了基因工程的研究。