免疫性疾病的实验室检查

免疫学技术近年来有很大进展，在以沉淀、凝集、溶解及补体结合等传统方法检测体液中抗原或抗体的基础上，发展了许多新技术(表1)。当代免疫学检测方法则以各种标记技术为特征，具有敏感性高、微量定量、准确定位和分析等性能，且可检测免疫复合物和研究细胞免疫。

表1 常用体液免疫检查法

方 法	用 途
凝胶沉淀反应 双向免疫扩散(凝胶双向 扩散、免疫电泳、对流电 泳) 单向免疫扩散 (单向环状 扩散、火箭电泳、交叉免 疫电泳)	血浆及体液中各种异常Ig的 定性分析（如自身抗体）及 抗原检查 血浆及体液中各种Ig及补体 各成分C3、C2、C4的定量测 定(用于免疫缺陷病、免疫 增殖病、部分自身免疫病)
醋酸纤维膜电泳	血及尿中的M-蛋白检测
50%溶血试验(CH50)	血中总补体活性
补体介导的细胞毒试验	HLA定型试验(免疫遗传性 疾病的检查)
琼脂平板打孔法或光学法	血中溶菌酶含量测定 (免疫 缺陷病)

循环免疫复合物测定 免疫复合物的形成在体内是经常发生的，可迅速被体内单核吞噬细胞吞噬、消化和清除。只有当形成的免疫复合物不易被清除或沉积于局部时，才有致病作用。免疫复合物本身不是引起组织损伤的主要因素，但它是引起免疫复合物性疾病的始动原因，最重要的生物学效应是激活补体，导致组织损伤。观察血中循环免疫复合物的动态变化，有助于判断血管炎、系统性红斑狼疮、肾脏病等自身免疫病的活动性、预后和疗效。除自身免疫病外，细菌感染，如亚急性细菌性心内膜炎、麻风等；病毒感染，如流行性出血热、传染单核细胞增多症，病毒性肝炎等；原虫感染，如疟疾、血吸虫病等； 以及某些肿瘤，都可出现循环免疫复合物。因特异性不强，现有的检测方法无助于阐明病因，但可以判断疾病的活动性、药物疗效和作用机制。
免疫复合物是异质性的，检测方法多样，已报告有30多种。由于每种方法检出的免疫复合物不尽相同，且相互交叉重叠，因此最好使用几种方法以便检出某种疾病所固有的免疫复合物。免疫复合物检测技术.是以其理化及生物学特性而分类的(表2)。

表2 循环免疫复合物检测法

检测原理	类 型
免疫复合物的分子大小	超速离心 凝胶过滤
复合物理化性质	冷沉淀反应 聚乙二醇沉淀试验
复合物与C1组分结合	抗补体活性测定 C1q放免或酶标测定 胶固素结合试验
复合物与Fc受体结合	单株或多株类风湿因子结合 试验 K细胞抑制试验
复合物与细胞上C3b及Fc 受体结合	Raji细胞 巨噬细胞 中性粒细胞 B淋巴细胞

细胞免疫检测技术 细胞免疫功能测定有体内及体外两种方法，前者是通过迟发型皮肤变态反应，间接观察T淋巴细胞对抗原、半抗原或丝裂原的应答效应；体外法多用检查细胞表面标志(受体、分化抗原) 以进行分类、计数，并观察丝裂原[植物血凝素(PHA)、刀豆素蛋白(ConA)]诱导的淋巴细胞转化试验或对相应靶细胞的细胞毒作用，以测定其免疫功能。最近开展检测淋巴因子，特别是白细胞介素2，以期从细胞或分子水平上了解人体细胞免疫功能状态。在此仅介绍细胞介导的细胞毒试验，主要有以下三类。
(1) T细胞介导的细胞毒反应： 参与此反应的细胞为细胞毒性T细胞，又称杀伤T细胞。检测其细胞毒功能的有：
❶⁵1Cr释放法： 铬酸钠(Na₂⁵¹CrO₄)标记的靶细胞被CTL攻击破裂时，胞浆中核素可释放于上清，测上清中核素，即为CTL的杀伤能力；
❷单细胞水平检测法： CTL与相应靶细胞结合，形成CTL-靶细胞连接物，置琼脂培养基中孵育，然后显微镜下计算结合物中台盼蓝着色（死细胞）靶细胞数得出杀伤率。
(2)天然杀伤细胞的细胞毒试验活性： 有核素标记和细胞水平测定两种方法。均需体外传代肿瘤细胞作为靶细胞。常用方法为：
❶125IUdR释放法： 其基本原理是1²⁵IUdR中的碘与胸腺嘧啶分子中甲基的空间构型相似，因此¹²⁵IUdR可作为一种类似物取代胸腺嘧啶参入到传代肿瘤细胞的DNA分子上，参入后的125IUdR不会自动释放出来，若释放则反映靶细胞死亡。正常情况下，胸腺嘧啶参入DNA的能力比125IUdR强2～5倍。效靶细胞孵育15～20h，分别测定试验管及自发释放管上清及细胞部分放射性，计算特异细胞毒百分数。
❷双靶细胞结合测定： 其特点是一种效应细胞结合两个不同种类的靶细胞。由于外周血中的大颗粒淋巴细胞(LGL)可同时介导天然杀伤细胞(NKC)和抗体依赖细胞介导的细胞毒活性，采用NKC敏感的K₅₆₂细胞株及NKC不敏感但有抗体包被的Raji细胞，即可观察到LGL可同时结合这两种细胞并将其杀死。
(3) 抗体依赖细胞介导的细胞毒(ADCC)试验：本试验为测定体内杀伤细胞(KC)活性。KC包括多形核中性粒细胞、嗜酸粒细胞、单核细胞、巨噬细胞，以及某些淋巴细胞亚群，都具有Fc受体，桥联抗体Fc分段，产生ADCC效应。测定法有：
❶放射性核素释放法： 以51Cr标记靶细胞（鸡红细胞或传代肿瘤细胞）后，用适宜稀释度的抗血清致敏靶细胞，最后加入效应细胞悬液。计算上清中的脉冲数作为反映ADCC活性的参数；
❷溶血空斑法：用赖氨酸使红细胞形成单层，经抗靶细胞抗体致敏，置效应细胞悬液中培养，在光学显微镜下观察空斑数目，以反映效应细胞数量。
免疫标记技术 应用各种标记物(荧光素、酶、放射性核素、生物素、抗生物素)、标记抗体、抗原或相关靶细胞，即能使难以观察的抗原、抗体或细胞毒显示出来，不仅能提高检测的敏感性，对微量物质进行定性或定量检测，而且结合显微镜和电镜技术，能对所测样本进行细胞或组织的准确定位，有助于免疫性疾病的诊断、预后判定及发病机理的探讨。
(1)免疫荧光技术： 又称荧光抗体技术。此法具有血清学的特异性，荧光色素的敏感性，并与显微镜法结合起来，可以特异、敏感、快速地检出和定位某些未知抗原或抗体，特别是自身抗体。荧光抗体技术主要包括抗血清制备、抗体纯化，制备荧光标记抗体，标记抗体纯化，荧光标记抗体染色，显微镜标本制备及显微镜观察。常用荧光抗体染色法有直接及间接法两种，前者为荧光素标记待查抗原的特异性抗体，如狼疮带试验等；后者是荧光素标记抗抗体。用间接免疫荧光法可以不断发现新的自身抗体，现已检出甲状腺球蛋白抗体、甲状腺微粒体抗体、甲状腺第二胶质抗体、肾上腺抗体、胃壁细胞抗体、胃G细胞抗体、皮肤表皮间粘合质抗体、胰岛细胞抗体、唾液腺导管上皮细胞浆抗体、精子抗体、卵巢抗体、心肌抗体等器官特异性自身抗体。非器官特异性自身抗体有各种类型抗核抗体、平滑肌抗体、横纹肌抗体、神经髓鞘抗体、网状纤维抗体，以及血液有形成分(红、白细胞、血小板等)的自身抗体。
(2)放射性核素标记技术：用放射性核素标记抗体、抗原或相关靶细胞进行血清学或细胞毒（前述）试验，敏感性高且较客观，适用于微量物质的检出或定量，能分析1pmol～1fmol水平的微量物质，已广泛用于各种激素、药物(地高辛、吗啡)、免疫球蛋白(IgD、IgE)、环核苷酸(cAMP、cGMP)的测定。可分为：
❶放射免疫测定(RIA):将待测未标记抗原同已知标记抗原竞争有限量的抗体结合部位，反应达到平衡时，一部分标记抗原和未标记抗原与抗体结合，有些则游离存在，再用抗抗体把结合于抗体和游离的抗原分离开来，分别测其放射性。结合于抗体的放射性标记抗原的数量与待检样品中未标记抗原存在数量成反比关系，通过标准曲线可求得未知抗原数量；
❷免疫放射测定(IRMA): 此法与RIA不同点在于标记抗体，将过量的放射核素标记的纯化抗体与待测抗原一起孵育，再加入到结合已知抗原的固相免疫吸附剂上，此过剩抗体可与免疫吸附剂结合，离心使之分离。未结合到吸附剂上的核标记抗体量与待测抗原量成正比，测定前者即可作为后者的指标。
(3)免疫酶技术 (EIA):此技术是把抗原抗体反应和酶的高效催化作用原理结合起来，其敏感度接近放射免疫测定，可直接肉眼观察，亦可借助于酶标读数器进行定量测定。EIA包括：
❶免疫过氧化物酶法：应用辣根过氧化物酶作为一种标记，通过酶与其底物间组织化学反应所产生的不溶性颜色产物，借助光学或电子显微镜，在细胞或亚细胞水平观察待检抗原或抗体。该法根据其作用方式，分为直接和间接两种，可代替免疫荧光技术，作为免疫病理和自身免疫病的研究，检查肾病患者肾活检标本，天疱疮和系统性红斑狼疮患者皮肤活检标本中所结合的免疫球蛋白，以及自身抗体的检测。
❷酶联免疫吸附试验法 (ELISA): 该法的主要原理为，抗原或抗体结合到固相载体的表面，仍保持其免疫活性，抗原或抗体与酶相结合所形成的结合物仍保持各自的免疫活性和酶的效应。当结合物与相应待查的抗体或抗原反应后，结合于免疫复合物上的酶使相应的底物水解、氧化或还原，从而产生有色物质。颜色反应的深浅与相应待测样品中的抗体或抗原量成正比，可藉以判定测定结果。
近年来尚采用过氧化物酶-抗过氧化物酶(PAP)复合物及生物素-抗生物素系统用于酶技术，使其敏感性、准确性、快速性都得到很大提高。生物素是小分子蛋白质，由卵黄囊提取，抗生物素是碱性糖蛋白，存在于鸡蛋清中，正常情况下为四聚体，每一个单体结合一个分子生物素，故每个分子抗生物素可与4个分子生物素结合，两者皆能标记荧光素、酶、铁蛋白，生物素尚能与免疫球蛋白Fc分段结合。生物素-抗生物素系统检测方法有：
❶标记抗生物素-生物素技术(LAB): 抗体固相吸附+待检抗原+生物素化抗体（经孵育和洗脱）+酶标抗生物素(孵育，洗脱)+底物（显色）;
❷桥连抗生物素-生物素技术(BRAB):抗体固相吸附+待检抗原+生物化抗体+抗生物素+酶标生物素+底物；
❸间接桥连抗生物素-生物素技术(IBRAB):主要用于切片染色，组织抗原+特异抗体+生物素标记抗抗体+抗生物素+酶标生物素+底物；
❹抗生物素-生物素复合物技术(ABC):组织抗原+特异抗体+生物素化抗抗体+抗生物素-生物素过氧化物酶复合物+底物。