作物缺氮组织速测诊断法crop tissuequick test for nitrogen deficiency

采作物某一特定组织鲜样，用简捷的化学方法进行成分测定以判断作物是否缺氮。通常用于田间诊断。因旱作与水稻吸收氮形态以及转化过程的不同，方法也不同。
旱作缺氮组织速测诊断 旱地作物一般都吸收NO^-₃-N，进入体内后经硝酸还原酶还原成氨，与有机酸结合成氨基酸再缩合成蛋白质。在这一过程中部分硝(NO^-₃)以游离态存在，其数量能反映作物氮营养状况，所以旱作可以直接测定NO^-₃的含量来判断氮的丰缺。检测NO^-₃可以用几种试剂或方法。
二苯胺法 硝(NO^-₃)遇溶于硫酸的二苯铵，产生蓝色，蓝色的深浅可反映硝态氮浓度（高低），此法简单。以二苯胺浓硫酸试剂(1克二苯胺溶于100毫升浓硫酸)滴注于供试组织切口或样品碎片，根据显色情况作出判断。如不显蓝色表示无硝酸盐存在即缺氮，深蓝色表明硝酸盐充足。但此法由于试剂中浓硫酸有强的腐蚀性，携带不便，一般应用较少。
硝酸试粉法 硝酸试粉(由锌粉，对-氨基苯磺酸、α-萘胺、硫酸锰、柠檬酸等多种试剂混配而成)与硝酸根(NO^-₃)作用时，先被试粉中锌与酸作用产生的氢(H⁺)还原成亚硝酸(NO^-₂)，再与对-氨基苯磺酸反应，并与α-萘胺偶合形成红色偶氮染料使试液呈红色。红色深浅在一定范围内与硝态氮浓度成正比。田间约测时取植株下位叶叶柄（或叶鞘）供试，尽可能剪细混匀。取1克左右，置试管中加蒸馏水(8毫升)和10%醋酸(2毫升)，振摇后加硝酸试粉一小勺显色，目测红色深浅作丰缺大致判断，以微红—淡红为缺乏，中等红色为一般，深红色为丰富。这样的测定通常需要同时测定正常植株含量以作比较。如作点滴测试，则以植株汁液湿润滤纸，用牙签撒上少许硝酸试粉，折叠滤纸并挤压以湿润试粉，作用一些时间，使显色。如试粉不变红色表示无硝酸盐存在，粉红色为足够，深红色为丰富或过量。操作中在汁液湿润滤纸时，根据不同作物和取样部位，方法上可以灵活变换，或以样本夹汁，或直接将滤纸贴附于组织切面（如成长后的玉米茎）等。如用叶片因叶绿素干扰可用双层滤纸去湿润，以其中一层滤去叶绿素。作标准色阶比色法测定时，需配制标准色阶。取硝酸钾0.3610克，定容500毫升成含NO^-₃--N100毫克/千克的标液，配成1,2毫克/千克，4毫克/千克，6毫克/千克，8毫克/千克，10毫克/千克系列浓度。用指形比色管以10%醋酸稀释，控制比色液为5毫升，发色成标准色阶，也可制成永久性比色卡。试样汁液按配制标准色阶方法操作发色，比色读得浓度，乘以试样稀释倍数即为作物体NO₃-N含量(毫克/千克)。
水稻缺氮组织速测诊断 水稻一般不能吸收NO-3-N而吸收NH⁺⁴-N，进入稻体的NH⁺⁴直接与有机酸结合而很少滞留，故植株体内通常是既没有游离NH₄⁺，也没有NO^-₃，所以水稻植株氮的速测不能以测定上述两种无机氮来完成。需要测定可溶性有机氮或与植株含氮率有密切相关的物质如淀粉含量来判断。
叶鞘碘—淀粉诊断法 淀粉遇碘呈蓝色，蓝色深浅表示淀粉的多少。水稻进入幼穗分化期后，叶鞘中开始积累淀粉，其量与植株含氮率呈良好负相关(表1)。

表1 水稻叶片含氮率与叶鞘淀粉含量

硫铵基肥用量 (g/3.3m2)	叶片含氮率 (%)	叶鞘淀粉率 (%)
0 75 100 125 150	2.16 2.65 2.72 2.93 3.29	22.9 20.5 17.8 11.6 6.5

由于淀粉在叶鞘中积累是由下而上逐步上升，因此检测叶鞘淀粉积累高度，可以大致判断水稻植株氮素营养状况(参见图1)。也由于淀粉只在幼穗分化期才有显著积累，故此法一般作为水稻穗肥需要与否的判断。测定方法是：从田间取有代表性样本（主茎）10～20个，用心叶下第2或3叶鞘供试。沿叶鞘脊部自上而下纵剖成一长条（不能断），浸入0.1%碘溶液染色数分钟，其时有淀粉部分被染成蓝色，染色部分长度为A，叶鞘总长度为B(见图2)，以B/A值判断稻体氮营养状况：B/A<0.3～0.4为高氮，施氮无效或甚有害；0.5～0.6为正常，一般不需施氮，如天气晴朗多日照，适量施用可能有效；>0.6～0.7为缺氮，施氮有效。为避免量算麻烦，可将样株（茎）数固定为10或20，按叶鞘各自长度分为3等分，合为30(或60)段，同上法染色，计算染色段数。其中部分染色的按染色长度>1/2为染色段，<1/2为无色段。以总染色段≤10(或20)为高氮；≤15(或30)为正常；≥20(或40)为缺氮。两者结果基本一致。

图1 水稻含氮量与叶鞘碘—淀粉染色程度

图2 叶鞘碘淀粉测试时的“A”、“B”示意

天门冬酰胺检出诊断法 酰胺在水稻体内是氮的一种贮藏形态。供氮丰富，吸收速度大于合成速度时体内会有酰胺出现。故如有酰胺检出时表明氮已过量，不宜追肥，否则可施。酰胺检出用纸上层析茚三酮显色。方法是：从田间取代表性植株若干，尽快取下心叶剪取其绿色部分供试。按(图3)所示顺序进行：即夹汁；分剪滤纸并滴注汁液；以含0.2%水合茚三酮的丁醇、醋和水(4∶1∶1)配成的展布剂在密封器内平皿中展布，取出用烘箱(80℃)或热风机吹干，显色。由于天门冬酰胺在水稻汁液中Rf值最小，即色斑中心到原汁点的距离最小，且呈灰青色（其他氨基酸呈紫红色），极易辨认。此法操作中必须注意样本新鲜，如采样后搁置时间长，可能引起植株蛋白质水解出现酰胺而使结果失真。

氨基酸总量诊断法 以氨基酸总量（包括酰胺）为水稻氮素营养水平的指标。游离氨基酸及酰胺均可与水合茚三酮作用产生紫蓝色，颜色深浅反映氨基酸总量亦即氮素水平的高低。田间约测用点滴试法。先制作试纸，将普通滤纸在0.55%茚三酮柠檬酸缓冲液(柠檬酸4.31克加柠檬酸钠6.86克再加蒸馏水500毫升，每100毫升加茚三酮0.55克)中浸湿，晾干即成。测定时取主茎老熟叶叶鞘供试，剪碎夹汁，稀释20倍，用塑料点滴瓶(图4)取稀释液1滴于试纸上，自然风干显色。目测判断紫灰色为低，紫蓝色为中，深蓝色为高。如作标准色阶比色测定，可取亮氨酸1.17克用pH值为5.0柠檬酸缓冲液溶解，定容500毫升成含氨基酸250毫克/千克标液。继用柠檬酸缓冲液分别稀释成10、15、20、25毫克/千克系列，并各取1毫升移入各试管中，加1%茚三酮酒精(茚三酮1克加无水酒精100毫升)1毫升，保温显色，再加柠檬酸缓冲液定容10毫升，制成1.0、1.5、2.0、2.5毫克/千克标准色阶。测定试样时，用汁液2滴，同上法操作，显色比色，以所得浓度乘试样稀释倍数(显色溶液毫升数/所取汁液毫升数)即为作物氨基酸含量。判断标准为：

汁液氨基酸含量(mg/kg)	氮水平
100	低↑
150 200	中
250	高↓

图3 天门冬酰胺检出法操作步骤示意

图4 塑料点滴瓶