丝蛋白合成biosynthesis of sil k pro-teins

丝素基因、丝胶基因的转录、转译以及转译后加工的过程，包括丝蛋白在腺细胞内的转运、分泌等一系列复杂的生化学过程与细胞学过程。丝蛋白为丝素与丝胶两类蛋白质的总称，是构成茧丝的主要成分。
外胚层起源的丝腺是产生丝蛋白的器官； 中部丝腺的腺细胞合成和分泌丝胶，而后部丝腺的腺细胞合成和分泌丝素。
桑蚕由于长期人工选择的结果，丝腺愈益发达，分泌丝蛋白的能力不断增强。80年代初，日本蚕丝试验场原九州支场选育的基础品种“BC₉”的茧层重已突破1克的记录； 中国大面积推广的春用品种茧层重一般亦有0.4～0.5克。
形成茧层的丝蛋白主要在5龄中、后期合成。在短短的5～6天内，后部丝腺每个细胞要合成丝素约300微克，亦即两条后部丝腺(大约1,000个腺细胞)每小时合成丝素2毫克左右，每个腺细胞平均每秒钟合成6×10⁸丝素分子。这样的蛋白合成强度，其他动物细胞内是罕见的。5龄蚕丝腺细胞内爆炸性的蛋白合成，由于近年来分子生物学与基因操作技术的进展，给丝蛋白合成机理，特别给丝素合成与分泌机理，提供了许多新的信息。
丝素的合成 幼虫进入5龄期以后，适应丝素合成的需要，整个后部丝腺细胞内的代谢系统以及亚细胞结构都发生巨大变化。以丝素合成与分泌为中心，葛雷尔(Jean-pierre Garel,1982)把5龄期的后部丝腺细胞所经历的变化划分为3个生理时期：❶成长期：5龄饷食4天以内，后部丝腺重量急速增长，细胞内DNA进行复制，DNA含量增加，丝素基因转录、转译与转运分泌系统建立起来，丝素信使核糖核酸(mRNA)开始积累。
❷大量合成与分泌期：后部丝腺合成丝素总量的75%与中部丝腺合成丝胶总量的50%，均于饷食后4～8天内完成。在22℃条件下，后部丝腺合成丝素的平均速度为4个氨基酸/秒/核蛋白体，即25分钟内，一个核蛋白体在模板核糖核酸(mRNA)上可将丝素分子的4,700个氨基酸残基连结起来，而丝素分子在细胞内转运分泌，比这个速度还要快，在15分钟内即可完成。
❸吐丝与细胞解离期：最后3天，完成吐丝营茧过程并进入变态期，丝腺细胞被消化。化蛹后，腺细胞全部消失，而丝腺DNA转移到脂肪体组织暂时贮存起来。腺细胞内DNA合成，核蛋白体核糖核酸(rRNA)与转移核糖核酸(tRNA)合成，丝素模板核糖核酸mRNA合成，以及丝素合成，在5龄蚕体内呈现严格的时间顺序，这就表明丝素合成也是符合基因表达的一般规律即中心法则的：DNA→RNA→蛋白质。
丝素基因 桑蚕后部丝腺5龄期高效率合成丝素蛋白，首先与每个腺细胞内含有丝素基因的数量有关。桑蚕丝腺在胚胎发生期进行分化，胚后发育期细胞已停止分裂，但随着染色体复制，细胞核发生复杂的分枝形态变化，细胞形状增大。在幼虫期，腺细胞染色体分裂19次（产丝量少的品种）到20次（多丝量品种），再加胚胎发生期细胞分裂10次，则丝腺细胞2倍体的染色体组共计复制29至30次。由于幼虫期染色体组复制而细胞不分裂，故后部丝腺细胞内染色体组呈多倍体。已查明单倍体染色体组内只含1个丝素基因，故推算后部丝腺一个细胞内含丝素基因为5×10⁸个（产丝量少的品种）至2×10⁹个（多丝量品种）。这是后部丝腺细胞在5龄期所以能高速合成丝素的分子遗传学基础。
丝素基因系由16,000个碱基对(16kb)构成，含有合成丝素分子的信息DNA部分，称为丝素结构基因。A、C标明+1的部位，向正的方向(近3’端)有ATCAG序列，向负的方向(近5’端)隔一个C，也有ATCAG序列，构成ATCAGCATCAG序列，其中第2个ATCAG即相当于丝素基因的5’末端，与成熟丝素mRNA的5’末端相应。+1又称帽子位点，因为经过转录后加工，形成丝素mRNA的帽子结构m7Gppp AmUm^CA……。丝素基因5’末端的上游（负方向）有5’侧翼序列，其中有一段序列的AT含量特别高(高达75%，而丝素结构基因内部的AT含量占40%),-30至-24即为一个TATA序列，是RNA多聚酶Ⅱ的启动子部位。靠近丝素基因5’末端还有大约970碱基对的插入序列(插入子从+67至+1036碱基对)。这个插入序列内的密码子几乎都与疏水性信号肽链的氨基酸相对应。疏水性信号肽链与分泌蛋白通过糙面内质网膜有关，对丝素分子在细胞内转运与分泌具有重要意义。虽然转录开始的密码子是+25部位(ATG)，但真正代表丝素蛋白结构的密码子(即出现甘氨酸—丙氨酸密码子重复排列的序列)要在+1420碱基对以后才出现。在丝素基因中，结晶性部分的肽链密码子与无定形部分的肽链密码子呈有规律的相间排列。丝素基因的3’末端根据互补DNA链测定的核苷酸序列为……TACAAAAAAAAAAGCAATTATTTACTCTCGTAA(斯泼拉盖，Sprague,K. U.1979)
丝素基因不仅存在操纵子，而且还有启动子，后者系调节转录的重要部位。
丝素基因的转录 丝素mRNA各龄均有合成，但于眠中被分解，故5龄期丝素mRNA都是当龄合成的。5龄整个食桑期与熟蚕期丝素mRNA继续不断地合成，占腺细胞内总RNA的4%，眠中丝素mRNA合成停止，表明丝素基因的表达可在转录水平上进行调节。桑蚕4次眠起，丝素基因的“开关”，都起开与关的调节作用。
5龄后部丝腺的细胞内，甘氨酸与丙氨酸的(tRNA)转录频度比其他氨基酸的tRNA高得多。这种有选择的转录tRNA，是因为丝素分子中这两种氨基酸含量特别高的缘故。
丝素mRNA的转录酶为RNA多聚酶Ⅱ，而tRNA的转录酶为RNA多聚酶Ⅲ。
转录产物丝素mRNA，分子量平均为5.8×10⁶道尔顿(电泳测定为6.0×10⁶，而电镜测定为5.6×10⁶)，沉降系数为42s，相当1.6×10⁴碱基。丝素mRNA的5’末端有帽子结构，其中60%为甲基化的7^m GPPPA^mU^mCXG结构，而其余40%为没有甲基化的GPPApy结构。3’末端有多聚腺苷酸poly (A)结构，其长度约为100～150碱基。
丝素mRNA的转译 丝素基因位于第25染色体上，这个基因被特定的转录酶RNA多聚酶II转录，并在核内经过转录后加工为成熟丝素mRNA，进入细胞质内，与50～80个核蛋白体结合，称多聚核蛋白体，在那里转译成丝素蛋白。
与一般蛋白质合成过程一样，丝素mRNA的转译，也要经过起始反应、延长反应与终止反应3个阶段。
5龄期后部丝腺细胞内的肽链，N末端多数为蛋氨酸，而且丝素合成最旺盛的时刻，腺细胞内tRNAfmet也显著增多，说明丝素合成是从蛋氨酸开始的。
但实际上丝素分子的N末端并非蛋氨酸，这是因为从丝素mRNA转译出来的蛋白质，经过转译后加工，把包括蛋氨酸在内的多余残基又切掉了。即在丝素mRNA上先以蛋氨酸密码子作为转录起始点，合成丝素前躯物（丝素原蛋白），再经过加工，切除N末端多余的肽链（信号肽链），这种信号肽链对于丝素通过糙面内质网膜，特别在外分泌过程具有重要意义。
丝素合成过程中，有3种延长因子，即EFla、EFlb与EF2参与反应。EFla(分子量51,000)参与氨基酰—tRNAn+1与核蛋白体的结合反应，在核蛋白体内氨基酰-tRNAn+1与肽基-tRNAn反应，使后者的肽链延长一个氨基酸，成为肽基tRNAn+1。这一反应称为肽基转移反应，在肽基转移酶参与下进行，而无需ATP,GTP等能源化合物参与。
肽基转移反应新生成的肽基—tRNAn+1，在延长因子EF₂(分子量80000)的作用下，发生移位反应，从A位（氨基酰位点）移到P位（肽链位点），这一反应需有GTP参与(1分子肽基—tRNA移位，需水解1分子GTP)。
EFlb(分子量26000)在EFla活性再生中是必要的因子。
丝素结构模型 转译的基因产物——丝素，是由结晶部分与无定形部分构成，前者约占60～65%，后者约占35～40%，在丝素合成时，结晶部分与无定形部分交替进行转译。结晶部分的基本单位由59个氨基酸构成，即甘—丙—甘—丙—甘—丝—甘—丙—丙—甘—(丝—甘—丙—甘—丙—甘)8—酪。4～7个这样的基本单位（重复序列），构成一个区段，每个丝素分子内有这样的区段10个左右。区段与区段之间各有一条200氨基酸残基构成的无定形部分相连接。主链在细胞内转运时有糖分子（甘露糖与氨基葡糖）与丝素无定形部分相结合。此外，还有辅球蛋白，藉二硫键与主链相联。这种辅助球蛋白与丝素的溶解性以及细胞内转运有关系。
无定形部分已发现3组肽链，具有甘氨酸重复序列，并以酪氨酸（羧基）结尾。不同蚕品种间，丝素分子内区段的数目及长度可能不同，而结晶部分与无定形部分亦可能有变化。丝素分子的多型性，是不同蚕品种间丝质存在差别的根本原因。
丝素的转运与分泌 合成的丝素分子主链，通过糙面内质网膜，被转移到高尔基体，在那里浓缩加工，某些氨基酸残基与糖分子结合，然后形成分泌泡，与高尔基囊泡断离，移近腺细胞顶部的质膜，通过微管与肌动蛋白微丝的作用，丝素分子以溶解状态被分泌进后部丝腺腔内。丝素分子进入高尔基体并分泌出去，速度是很高的，通常少于15分钟，比合成一个丝素分子(25分钟)还要快。
被分泌进后部丝腺腺腔内的丝素，向前流进中部丝腺（贮丝部），并贮存在那里，直到吐丝营茧。丝素分子集合成微纤丝、纤丝，直径由0.01微米增加到0.4微米。
丝素合成的调控 丝素的合成，要通过很多阶段：丝素基因的转录、丝素mRNA的转译、丝素分子的转运与分泌。在每一阶段每一环节都可能受到调节控制。转录水平的调控不仅对丝素mRNA，而且对与丝素合成有关的tRNA、rRNA、延长因子的产生也有重要作用，并直接影响丝素mRNA的转译。
腺细胞内的亚细胞组分，对丝素分子的转运与分泌有决定性影响。裸蛹突变型(Nd)与薄皮茧突变型(Flc)分别损坏了高尔基体的转运作用与分泌作用。裸蛹突变型后部丝腺内丝素mRNA含量比正常系少。正常系为90微克，而Nd₁系为0.8微克，Nd₂与Nd-s为1.3微克。因此，裸蛹突变系合成丝素数量少是可以理解的。但同时Nd突变系腺细胞内质网膜之瀦泡膨润，而高尔基体与线粒体均不发达，故生成的丝素分子的转运与分泌不正常。Flc突变系在5龄前3日，丝素分泌颗粒的质与量，均与正常系相似，但5龄3日以后，Flc突变系腺细胞内质网膜中分泌颗粒逐渐积累，但不能分泌到腺腔中去。
丝胶的合成 桑蚕丝腺是高度分化了的器官，后部丝腺专门合成丝素，而中部丝腺专门合成丝胶。这种同一器官中组织特异的基因表达现象是丝蛋白合成的一个最大特点。
根据电泳移动速度快慢，丝胶可分成A、B（慢）、C（中间）与D（快）4种蛋白(基因产物，表型)，交配这4种表型的基因均位于第11染色体上。其中支配表型C的丝胶基因(Src—2)与支配A、B、C的丝胶基因(Src)之间的重组率为7.1，第11连锁群的染色体图为：Src(0.0); Src—2(7.1); K(19.2);mp(47.8)。
对已分离出来的两个中部丝腺特有的mRNA(11.0kb与9.6kb代表两种丝胶蛋白的信使)的研究结果表明，丝胶基因与丝素基因一样，也具有一个5′端侧翼序列和至少3个插入序列(丝素基因只有1个插入序列)。体内转录起始位点的核苷酸序列，与成熟丝胶mRNA的5′末端相应。丝胶基因5′末端的侧翼序列中—111与—186附近的核苷酸序列与丝素基因5′侧翼序列同源。这可能与丝胶基因、丝素基因在丝腺内协调表达有关。
1～4龄食桑中，丝胶的mRNA与丝素mRNA协调地分别在中部丝腺与后部丝腺细胞内转录与合成，而眠中也同时消失。两者很可能受同一激素调节系统控制。
丝胶是多种异质蛋白的复合物，根据溶解难易和分子量大小不同可分成丝胶Ⅰ，丝胶Ⅱ，丝胶Ⅲ，与丝胶Ⅳ4种。它们分别由中部丝腺前、中、后区不同部位的腺细胞合成与分泌。
中部丝腺分泌的4种丝胶，不仅有明显的部位特异性，而且还有严格的时间顺序，即从后区、中区与前区先后依次分泌丝胶Ⅳ，丝胶Ⅲ，丝胶Ⅱ与丝胶Ⅰ，并依次层积在从后部丝腺腺腔进入中部丝腺腺腔内的液状丝素外面。由于丝胶Ⅳ是后区腺细胞分泌的，故最早与进入中部丝腺腺腔的丝素接触，紧贴于丝素表面，呈一层薄膜，其氨基酸组成、二级结构均与其他丝胶不同，是最难溶解于热水与碱液中的丝胶层。在丝胶Ⅳ外层，依次为丝胶Ⅲ，丝胶Ⅱ与丝胶Ⅰ。这样难溶性与分子量递减的丝胶Ⅳ，丝胶Ⅲ，丝胶Ⅱ与丝胶Ⅰ，在丝素外面呈现层状构造。中部丝腺内液状丝胶的这种层状构造，大体也体现于茧丝中。
丝胶Ⅳ形成的薄膜，在中部丝腺内，使液状丝素与液状丝胶分开并防止两者混流。吐丝时，液状丝胶起着润滑油与激波吸收剂的作用。同时当液状丝素通过前部丝腺的细管时，内层丝胶Ⅳ，能防止丝素因切变应力作用而纤维化。因此，丝胶在保证茧丝形成的平顺进行方面具有重要意义。