鸡马立克氏病琼脂免疫扩散试验操作技术

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(一)材料准备

1．器材及用途：

(1)1毫升注射器，6－9号针头。数量按受检鸡数确定，针头号则根据受检鸡的大小确定。用于采集受检鸡的血液以分离血清。

(2)试管若干支(可按每只受检鸡2支作准备)。用于分离血清或浸提羽髓抗原。

(3)玻璃棒若干支，直径6－8毫米，长约16厘米，用于挤压羽根以浸提羽髓抗原。

(4)巴化滴管(带乳胶头)若干支。用于吸加标准抗原和标准阳性血清或受检材料(血清或羽髓浸液)。

(5)烧杯或磁缸3只，内盛适量蒸馏水。用于洗涤滴管和玻璃棒。

(6)打孔器4毫米直径一个(打中心孔)，3毫米直径一个(打周边孔)。

2．试剂：

(1)标准抗原：系冻干制剂，使用时用蒸馏水稀释到原量，直接加入到相应的孔中。

(2)标准阳性血清：系冻干制剂，用法同上。

3．琼胶平板：

(1)制底膜：用蒸馏水配制0．3%的稀琼脂糖溶液，使充分融化后，加入培养皿。每个直径8．5毫米左右的普通培养皿大约加3毫升琼脂液。置37℃温箱中充分干燥后备用。

(2)铺琼脂：用含8%氯化钠的磷酸盐缓冲液(0．01MpH7．4)配制1%的琼脂糖溶液，水浴加温使充分熔化，稍凉(60℃－70℃)后，加入上述备用培养皿。每个培养皿大约加20毫升。平置，在室温下凝固。然后放入普通冰箱中保存备用。

(3)打孔：按准备好的图形打孔。一般由一个中心孔和6个周边孔组成。中心孔直径4毫米，孔距约3毫米。

(二)操作方法

1．用标准抗原检测抗体(受检鸡血清)。

(1)用滴管将受检血清按顺序逐个地间隔滴加于周边孔内，以将孔加满而不溢出为度。每加一份血清前。必须把滴管充分洗净、拭干。

(2)用另一滴管向中心孔内滴加标准抗原，以加满为度。

(3)再用一支滴管向空下的周边孔内加入标准阳性血清，方法同上。

(4)将加样完毕的琼脂平板加盖后，在室温下静置片刻，待样品稍稍扩散而液面下陷后，平放于带盖的湿盒内，置37℃温箱中，于24小时内观察并记录结果。

2．用标准阳性血清检测病毒抗原(受检鸡的羽髓浸液)。

(1)选拔受检鸡含羽髓丰满的翅羽或身体其他部位的大羽数据(幼鸡8根，中、成鸡3－5根)，将含有羽髓的羽根部分按编号分别剪下收集于三分试管内。

(2)于每管内滴入2－3滴蒸馏水(羽髓丰满时也可不加)。

(3)用玻璃棒将羽根挤压于管底，并以适当的压力转动玻璃棒，倾斜试管，并用玻璃棒导流使羽髓浸液流至管口，另一人用滴管将其吸出，间隔滴加到周边孔内。

(4)洗涤玻璃棒并擦干，以同样操作浸提另一样品。

(5)用另一支滴管向中心孔内滴加标准阳性血清。

(6)再用一支滴管向空下的周边孔内滴加标准抗原。以上均以加满不溢出为度。

(7)加样完毕后的琼脂平板加盖后，……以下操作同上述1之(4)。

(三)结果判定

1．被检材料形成清晰的沉淀线并与标准的试剂的沉淀线相互融合，则判为阳性反应；不出沉淀线的则判为阴性反应。

2．标准阳性血清和抗原所产生的沉淀线末端弯向被检样品孔，则该被检样品判为弱阳性。

3．有的受检材料可能会产生1条以上沉淀线，仍属于阳性反应。