酶联免疫吸附试验(ELISA)

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本试验介绍二种方法——间接法和夹心法(以鸡新城疫为例)

(1)材料

①0．05M pH9．5碳酸盐缓冲液。

②洗涤液：0．01M pH7．2PBS(含0．13M NaCl，0．05%T_ween20)。

③30%H₂O₂。

④邻苯二胺(OPD)。

⑤pH5．0磷酸——柠檬酸缓冲液。

⑥2M H₂SO₄。

⑦抗原(新城疫病毒－NDV)。

⑧抗血清(鸡抗NDV血清)与抗体(鸡抗NDV IgG)。

⑨酶标记兔抗NDV IgG与酶标记兔抗鸡IgG。

⑩40孔聚苯乙烯酶联板。

⑾酶联免疫检测仪。

(2)操作

【间接法】

①用一定浓度的NDV纯化抗原(用碳酸盐缓冲液配制)包被酶联板，每孔200μl，置于37℃条件下2小时或4℃冰箱中过夜。

②倾去孔内液体，用洗涤液加满各孔，洗涤3次，每次3分钟，然后倾尽洗涤液。

③加倍比稀释的待检血清，每份血清加二排孔，即同一稀释液的血清加上下相邻的2个孔。注意：第一列孔为调零孔不加血清。血清应从第二列孔加起。每孔加血清100μl，同时没立阴性、阳性血清对照孔，37℃反应1小时。

④洗涤〔同②〕。

⑤除第一列调整孔外，每孔加入酶标记的兔抗鸡lgG100μl，37℃反应1小时。

⑥洗涤〔同②〕。

⑦每孔加入新鲜配制的底物溶液(取OPD40mg溶于100ml pH5．0磷酸盐－柠檬酸缓冲液，临用前加入30%H₂O₂0．15ml)150μl，37℃反应20－30分钟。

⑧每孔加入50μl2MH₂SO₄终止反应。

⑨用酶联免疫检测仪测定每孔OD490nm值。

【夹心法】

①用一定浓度的鸡抗NDV IgG(用碳酸盐缓冲液配制)包被酶联板，每孔加200μl，置于37℃条件下2小时或4℃冰箱中过夜。

②洗涤同间接法②。

③加不同稀释度的NDV抗原液，方法同间接法③。同时设立阴性与阳性对照孔。

④洗涤同②。

⑤加酶标记兔抗NDVIgG，方法同间接法⑤。

⑥洗涤同②。

⑦同间接法⑦。

⑧同间接法⑧。

⑨同间接法⑨。

【结果判定】ELISA常用的判定方法有3种。

①阴阳性判定法：待检孔OD490－阴性对照孔OD490≥ 0．2－0．3为阳性反应。

②P／N比法：待检孔OD490／阴性孔OD490≥2－3为阳性反应。

③效价判定法：以出现阳性反应的血清最高稀释度为该血清的ELISA效价。在夹心法检测抗原的试验中，以出现阳性反应的抗原最高稀释度为该抗原的ELISA效价或滴度。也可通过测定30份阴性对照血清吸收值来判定阴阳性反应，计算出阴性样本OD值平均值和标准差(SD)，以≥阴性样本平均OD值+3SD为阳性反应。

(3)注意事项

①包被过程中以高pH和低离子强度的条件为佳，包被的蛋白浓度应在1－100μg／ml选择最佳浓度。

②血清或NDV抗原稀释液应含10%异种动物血清或1%BSA或0．5%明胶，以起封闭作用，防止非特异性反应，或者在酶标记物中加入BSA或异种动物血清或明胶也可起到防止非特异性反应的目的。否则应在第②与③步之间加封闭液进行封闭。

③洗涤要充分，底物溶液一定要现用现配。

④显色过程中，阴性对照刚出现微黄色时，应立即终止反应。

⑤用P／N比方法判定结果时，阴性对照孔的OD490值应不小于0．1，否则易出现误判。

⑥用自动酶联检测仪检测时，应按规定确定调零孔，否则仪器不易阅读。

⑦同一稀释度2个孔OD490值的平均值为该稀释度的OD值。同理，阴性样本孔OD值的平均值为阴性对照的OD值。

(4)应用 自70年代建立ELISA方法以来，该试验已广泛应用于疾病的诊断，流行病学普查以及血清抗体的监测，间接法ELISA在实践中主要用于传染病血清抗体的监测与诊断。夹心法ELISA用于检测多种抗原(细菌、病毒)的抗原成分与诊断，譬如MD、IBD、IB、禽痘、网状内皮增生病、CAA、鸡病毒性肾炎、鸡霉形体、传染性鼻炎和鸡球虫等病原的抗原或抗体的检测。目前在这些禽病中的应用有的已用于生产，有的还囿于实验室中，有待于推广。

①IBD：国外已生产出试剂盒，用于雏鸡母源抗体的监测与疾病诊断。

②IB：用于检测IBV抗体。

③禽痘：用于检测禽痘病毒抗体。

④CAA：主要用于检测抗体。

⑤鸡病毒性关节炎：主要用于检测抗体。

⑥鸡霉形体：主要用于检测霉形体感染鸡的卵黄与血清中的抗体。

⑦传染性鼻炎：主要用于检测抗体。

⑧鸡球虫：主要检测球虫抗体。