血凝及血凝抑制试验

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多种病毒能凝集动物的红细胞，此种凝集作用可被相应抗血清所抑制，因此可用血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验鉴定病毒，也可用以测定病毒的HA价和血清中的HI抗体效价，有些传染病可直接从病料中检出病毒的血凝性，故可用于此类传染病的快速诊断。

一、血凝试验

(一)血凝素 流感病毒新城病毒等通常用感染鸡胚的尿囊液，收获后经3000rpm，离心15min，取上清液即可用于血凝，乙脑病毒通常从人工感染的鼠脑中提取血凝素，猪血凝性脑炎病毒可用细胞培养的离心上清液做血凝素，犬细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒和犊腹泻冠状病毒等均可用患畜粪便，以生理盐水1∶10稀释，离心取上清用于血凝。

兔出血症病毒通常用病死兔肝1∶10匀浆后，离心除去碎片，上清用于血凝。

(二)红细胞悬液 根据病毒血凝特性选用适当红细胞。流感病毒、新城疫病毒等粘病毒和副粘病毒通常用鸡红细胞，乙脑病毒用鹅红细胞，细小病毒用猪红细胞，冠状病毒用小白鼠红细胞，兔出血症病毒用人红细胞。采血后可加等量阿氏液，4℃保存，一般可用2周，应用时，加5倍生理盐水洗涤3次，至上清液透明无色，最后一次用1000rpm离心15min，取沉积红细胞配成1%红细胞悬液。

(三)血凝试验操作

试验可在5×10大孔塑料板或96孔微量滴定板上进行，大孔板操作法如下。

1．各孔加生理盐水0．25ml。

2．吸血凝素0．25ml于第一孔，混和3次后吸0．25ml于第二孔，依次倍比稀释至第9孔，弃去0．25ml，第10孔不加血凝素，为生理盐水对照。

3．用于病毒鉴定时，每一检样需稀释二排孔，第一排为血凝试验，第二排作阳性血清抑制对照，如用于血凝价滴定时，只用一排，不作抑制对照。

4．第一排各加生理盐水0．25ml，第二排加1∶10稀释的标准阳性血清0．25ml。

5．各孔加1%红细胞悬液0．25ml，混匀后，室温放置，经30、45和60分钟各观察结果一次。

微量血凝试验操作步骤同上，但用标准滴管稀释，每种成分1滴(0．025ml)，全量3滴(0．075ml)。

上述试验亦可采用可调的多管移液器加样，稀释，一次可同时稀释4～8个样品，十分方便。

某些病毒的血凝要求特定的条件，如细小病毒血凝要求在4℃下进行，乙脑病毒有的毒株要求在微酸条件下，才出现最高血凝价，试验时应予注意。

(四)结果判定 各孔凝集程度的判定标准同间接血凝，分别以++++、+++、++、+和一表示，以出现++以上的最大稀释度为该血凝素的血凝价，用于病毒鉴定时，第二排孔的血凝价必须显着低于第一排孔，表明血凝被抑制，为特异性凝集，判为阳性，如二排孔血凝价相等，或差异小于2个滴度者为非特异性凝集，或由其他病毒引起的血凝，应判为阴性。

放置时间太久时，强阳性孔亦可沉降于孔底，与阴性孔不易区别，可将滴定板直立放置数分钟，阴性孔红细胞下滑呈!号状，不下滑者判为阳性。

二、血凝抑制试验

(一)4个单位血凝素 血凝素按上法滴定后，按血凝价乘4，即4个单位血凝素的稀释度，如血凝价为1∶640，则1∶160，即为4个单位。

(二)待检血清 由于被检血清中常含有非特异性血凝物质和非特异性血凝抑制物质，故试前需按待检血清是否含有上述物质，作适当处理，前者通常用红细胞吸收法，后者一般应用胰酶或过碘酸钾处理，也可用高岭土吸收。

1．红细胞吸收法 0．1ml待检血清加0．4ml2%所试红细胞悬液，37℃作用30分钟后，离心除去红细胞，即成1∶5稀释血清。

2．高岭土吸收法 0．1ml待检血清加25%高岭土0．4ml，振摇混匀，置37℃作用30分钟后，离心除去高岭土即成1∶5稀释血清。

3．胰酶处理法 取0．2ml血清，加入0．2ml0．4%胰酶，56℃作用30min，再加0．8ml生理盐水，即成1∶5稀释血清。

4．过碘酸钾处理法 先将血清置56℃灭活30min，吸0．1ml，加入0．2ml新鲜配制的1／40(V／V)过碘酸钾溶液，4℃作用过夜，再加0．7ml0．4%甘油盐水以中和过碘酸钾作用，处理后的血清为1∶10稀释。

5．霍乱弧菌滤液处理 1份血清加4份霍乱弧菌滤液，37℃水浴过夜，再用56℃水浴加热50min，处理后血清的最终稀释度为1∶5。霍乱弧菌滤液的制备法附于本节最后。

用于鸡新城疫血凝抑制试验的血清毋须进行上述处理。

(三)试验操作 取5×10大孔板，按下表所示将待检血清倍比稀释，每份血清用1～8孔，第一孔的稀释倍数视处理后的血清稀释倍数而定，如血清未经处理，则于第1孔先加0．4ml生理盐水，然后加入0．1ml待检血清混和作1∶5稀释后，依次作倍比稀释，再依次加入4单位血凝素和1%红细胞悬液0．25ml，第9孔不加血清，为血凝素对照，第10孔不加血清和血凝素为盐水对照。

微量血凝抑制试验操作程序同上，各孔以滴计量，未处理血清，第1孔为1滴血清加1滴盐水，起始稀释为2×，稀释到第10孔为1024×，11、12孔为血凝素、盐水对照。

表9-18 血凝抑制试验式

另取一块板，或利用上述试验中剩余一排孔按下表稀释作血凝素效价校正。

(四)结果判定 以能完全抑制的血清最大稀释倍数为该血清的血凝抑制价，例如前面的血凝抑制试验表，其血凝抑制价为80×，但如血凝素校正试验的结果与预期的不一致，则需相应提高或降低该血清的血凝抑制价，如果1单位和0．5单位血凝结果为++++和++，表明血凝素抗原用量高了一个滴度，则该血凝价亦应提高1个滴度，为160×。相反，如1单位和0．5单位为+、一，则表明血凝素低了1个滴度，血凝抑制价亦应下降1个滴度，改为40×。

表9-19 血凝素效价校正

同一动物作双份血清(病初一份，以后一份)检查时，必须在同一次试验中测定，以便正确比较其效价，不同型病毒和不同型血清之间作交互抑制试验时，也应在同一次试验中测定。

霍乱弧菌滤液的制备方法如下。

将稻叶型霍乱弧菌接种于牛肉汤(新鲜牛肉浸汁液100ml，加氯化钠0．5g、蛋白胨2g，调pH至6．9，分装试管，每管8～10ml，10磅20min高压灭菌)，培养于37℃12h，取此培养液接种于牛肉汤琼脂(成份、制备，同牛肉汤，只是多含了1%的琼脂)，每平皿3滴，用L形玻棒于琼脂面上转匀，置37℃培养12h(琼脂面向上，勿倒置，因琼脂软)，取出，选无污染又生长好的平皿，用L形玻棒尽可能去掉面上菌苔，将琼脂部分移到有两层纱布的漏斗中，漏斗下有三角瓶。用长镊子将纱布中琼脂水分挤出。每100ml琼脂约可得50ml液体。将此液离心使细菌沉淀(4000r／min离心15min)，取上清用蔡氏滤器EK滤板除菌。将滤液接种于牛肉汤及牛肉汤琼脂各一管，每管2滴，培养，无菌后向滤液中加入硫柳汞达万分之一(每10ml滤液中加入1%硫柳汞0．1ml)，保存于4℃备用。操作时注意无菌、安全。