维生素B2的测定方法

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化学名：7，8－二甲基－10－〔(2S，3S，4R)－2，3，4，5－四羟基戊基〕－3，10－二氢苯并蝶啶－2，4－二酮(3，10－dihydro－7，8－dimethyl－10－〔(2S，3S，4R)－2，3，4，5－tetrahydroxypentyl〕－benzopteridine－2，4－dione

结构式：

分子式：C₁₇H₂₀N₄O₆

相对分子质量：376．37

一、维生素B₂的鉴别

1．试剂和溶液

1．1 稀盐酸溶液 取盐酸1mL，加水稀释至3mL。

1．2 稀氢氧化钠溶液 取氢氧化钠1g，加水溶解并稀释至25mL。

2．操作步骤

取本品约1mg，加水100mL溶解后，溶液在透射光下显淡黄绿色，并有强烈的黄绿色荧光。取此溶液25mL，加入0．5mL稀盐酸溶液，荧光消失；另取此溶液25mL，加入2滴稀氢氧化钠溶液，荧光消失。

二、维生素B₂

1．试剂和溶液

1．1 冰乙酸。

1．2 乙酸钠溶液 称取乙酸钠(GB－694)3．5g至250mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。

2．仪器

分光光度计。

3．测定方法

避光操作。称取本品150mg(准确至0．0002g)，置烧杯中，加冰乙酸2mL和水200mL，直至火煮沸溶解后，放冷，移置500mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。精密量取5mL，置100mL量瓶中，加乙酸钠溶液7mL，加水稀释至刻度，摇匀。按分光光度法，在波长444nm处，1cm杯，以水作空白，测定吸光度。

4．分析结果的表述

式中 w——核黄素的含量，%

323——C₁₇H₂₀N₄O₆的吸收系数

A——吸收度

m1——样品的质量，g

x₂——干燥失重，%

5．允许差

本方法平行测定的允许绝对差在1．5%以内。

三、维生素B₂的衍生物

化学名：核黄素酪酸酯(Riboflavin Tetrafutyrate)

结构式：

分子式：C₃₃H₄₄N₄O₁₀

相对分子质量：656．74

化学名：核黄素磷酸酯钠(Riboflavin phosphate sodium)

结构式：

分子式：C₁₇H₂₀N₄NaO₉P

相对分子质量：478．33

四、维生素B₂的测定方法

(一)荧光法

1．原理

维生素B₂能形成一种具有黄绿色荧光的黄色溶液，在稀溶液中维生素B₂的荧光强度与其浓度成正比，用高锰酸钾破坏干扰物质，利用维生素B₂可被连二亚硫酸钠还原为非荧光性物质，来消除其他可还原性荧光物质的干扰。根据还原前后的差数，可测得维生素B₂的含量。

2．试剂和溶液

2．1 25μg／mL维生素B₂储备液 3mL冰醋酸中溶解25mg维生素B₂，如需要可适当加温，并用水稀释到1000mL，在冰箱中保存，避免强光照射。

2．2 0．5μg／mL维生素B₂标准液 取维生素B₂贮备液1mL，用水稀释至50mL，随用随配。

2．3 50μg／mL荧光素钠贮备液 将50mg荧光素钠溶于1000mL水中。

2．4 O．05μg／mL荧光素钠应用液 将1mL荧光素钠储备液稀释至1000mL。

2．5 连二亚硫酸钠Na₂S₂O₄ 俗称保险粉，白色固体粉末。

2．6 0．1mol／LHCl溶液。

2．7 1mol／LHCl溶液。

2．8 40%NaOH溶液。

2．9 冰醋酸。

2．10 3%高锰酸钾溶液。

2．11 3%过氧化氢溶液(用时现配)。

3．仪器

荧光光度计。

4．测定方法

4．1 样品的提取。

4．1．1 称取若干磨细混匀的样品(根据经验，谷类、豆类、鱼、肉等取2～5g，水果、蔬菜取10～20g)置于150mL的三角瓶中，加入50mL0．1mol／LHCl，在高压锅中蒸煮30min。

4．1．2 样品经高压蒸煮后，冷却至室温，滴加40%氢氧化钠使pH至6．0，再迅速用1mol／LHCl调至pH4．5，使蛋白质等杂质沉淀。

4．1．3 用水稀释，定容至100mL，混匀后过滤，得清液，弃去最初的几毫升滤液。

4．2 提取液的脱色。

4．2．1 用移液管吸取4份10mL的样品液分别放入25mL的具塞试管中，并分成A、B两组。

4．2．2 在A组的两个试管中分别加入1mL水，在B组的两个试管中分别加入1mL维生素B₂标准液(0．5μg／mL)。

4．2．3 在以上4个试管中各加入1mL冰醋酸和0．5mL 3%的高锰酸钾溶液，混匀后放置2min以充分氧化样品内的杂质。

4．2．4 在以上4个试管中各加入0．3mL 3%H₂O₂，混匀使之褪色。

4．3 荧光测定。

4．3．1 选用激发波长为400nm，发射波长为530nm的两块滤光片，用荧光素钠溶液调整指针，使之每次都在一定的读数上(如50～80)。

4．3．2 测A管的荧光读数为A。

4．3．3 测B管的荧光读数为B。

4．3．4 在A管内加20mgNa₂S₂O₄，并混合，迅速测定，其荧光读数为C。

5．分析方法的表述

注：核黄素酪酸酯含量(μg／100g)=核黄素含量(μg／100g)×1．745

核黄素磷酸酯含量(μg／100g)=核黄素含量(μg／100g)×1．271

(二)比色法

在波长225nm、230nm、375nm及445nm处核黄素水溶液有最大吸收值。在波长445nm处测定用连二亚硫酸钠脱色前后溶液的吸光度，与同样操作的标准品比较可以定量。

本法不适用在波长445nm附近有最大吸收的共存物质的样品。