维生素B12的测定(比色法)

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维生索B₁₂(氰钴胺素)，分子中含有咕啉环，咕啉环的中心原子是钴。

维生素B₁₂主要存在于动物性样品中，如肝、心脏、瘦肉、鱼、牛乳、蛋类等。易溶于水和醇，不溶于丙酮和乙醚。

维生素B₁₂的提取剂是：称无水磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)1．4g。柠檬酸1．2g，焦亚硫酸钠(Na₂S₂O₅)1．0g溶解后稀释至100毫升。

本法是药品中维生素B₁₂的测定方法，样品用浓硫酸和高氯酸钾消化后，样液中的钴与M－二－(α－吡啶酮)－α－吡啶联腙生成钴的红色化合物，可进行比色测定。

试剂

(1)浓硫酸。

(2)高氯酸钾。

(3)显色剂：2%M－二－(α－吡啶酮)－α－吡啶联腙乙醇溶液。

(4)钴标准溶液：称0．100克金属钴(纯度99．9%)置250毫升烧杯中，加入1∶1硫酸溶液15毫升，加热溶解，冷却，移入1000毫升容量瓶中，加水至刻度，混匀，此液为0．1毫克／毫升。工作液的配制：取以上溶液10毫升定容至100毫升。此即为每毫升含10微克的钴。

操作步骤

1．标准曲线的绘制：准确吸取每毫升相当于10μg的钴标准溶液0．0，0．5，1．0，2．0，4．0，6．0，8．0，10．0毫升，分别置于50毫升比色管中，用氨水调节至pH5．5，加入2毫升显色剂，加入10毫升浓硫酸，此时形成粉红色钴的络合物。用水稀释至50毫升。用分光光度计，于波长500nm处测其光密度值。

以光密度为纵坐标，以钴含量为横坐标，绘制标准曲线。

2．样品的测定

(1)称取约含维生素B₁₂中钴量为7～100微克的样品，加入5～10毫升浓硫酸，0．2克高氯酸钾，进行缓慢地加热消化，消化完后，冷却，用10毫升水稀释，用氨水调节至pH5．5，加入2毫升显色剂，10毫升浓硫酸，显现粉红色。用水稀释50毫升，于分光光度计500nm波长下，测其光密度，从标准曲线中查出钴的含量。

3．计算：

式中：C：从标准曲线查出钴的含量(微克)；

W：样品重量(克)；

：从钴的含量转换为维生素B₁₂的系数。

〔注〕本法测定中，如果样品中含游离钴离子，将使测定结果偏高，可以预先用8－羟基奎宁－氯仿溶液提取分离除去。