用高效液相色谱同时测定食品中的B族维生素

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(维生素B₁、维生素B₂、维生素B₅、维生素B₆及叶酸)

1．试剂

1．1 盐酸、甲醇、硫酸 均为分析纯。

1．2 庚烷磺酸(天津化学试剂二厂)。

1．3 重蒸馏水。

1．4 盐酸硫胺素(B₁)、核黄素(B₂)、尼克酸(B₅)、盐酸吡哆醇(B₆)、叶酸(Sigma Co．USA冷冻保存)。

1．5 石英砂。

1．6 高峰淀粉酶(Serve Co．)

2．仪器

2．1 瑞典LKB公司高压液相色谱仪(色括2150型泵、2152型控制器、2220型积分仪、2151型紫外检测器)。

2．2 台式自动平衡记录仪(上海大华仪表厂)。

2．3 荧光检测器(日本岛津公司RF－530型)。

2．4 旋转蒸发器(2FO－81型)。

2．5 恒温水浴。

2．6 酸度计。

2．7 样品过滤器(Waters Co．)0．45／nm微孔滤膜。

2．8 高压灭菌锅。

2．9 U-Bondapak C₁₈分析柱(Waters Co．)。

2．10 超声波清洗器。

3．标准液配制

所有维生素标样在称量前都要在装有五氧化二磷的干燥器中干燥24h，并应在避免阳光直射的避光条件下配制标准溶液。

3．1 盐酸硫胺素贮备液 称取10mg盐酸硫胺素加入25mL无水乙醇，再用0．1mol／LHCl溶液定容至100mL，使其最终浓度为100μg／mL，于4℃冰箱中保存。

3．2 核黄素贮备液 准确称取10mg核黄素溶于含1ml冰醋酸的重蒸水中，使最终浓度为100mg／mL，于4℃冰箱中保存。

3．3 尼克酸贮备液 准确称取10mg尼克酸，加入25mL无水乙醇，再用重蒸水定容至100mL，使最终浓度为100μg／mL。

3．4 盐酸吡哆醇贮备液 准确称取10mg盐酸吡哆醇，用0．1mol／LHCl溶液定容至100mL，使最终浓度为100μg／mL。

3．5 叶酸贮备液 准确称取10mg叶酸，加入1mL0．1mol／LNaOH溶液，然后用重蒸水定容至100mL，使最终浓度为100μg／mL。

3．6 5种维生素工作液 取上述五种维生素贮备液各2mL，然后用重蒸水分别定容至100mL，使最终浓度为2μg／mL，上机前配制。

3．7 5种维生素混合工作液 取5种维生素贮备液各2mL，加入到同一个容量瓶中，然后用重蒸水定容至100mL，使最终浓度为2μg／mL，上机前配制，以免分解。

4．色谱操作条件

色谱柱：U－Bondapak C₁₈(Waters Co．)3．9mm×300mm；

流动相：30%甲醇70%重蒸水加入0．005mol／L庚烷磺酸离子对试剂(PIC－B7)，使pH保持在5左右，上机前于超声波清洗器中脱气30min；

流速：1．0mL／min；

检测器：紫外254nm；

荧光EX=290nm EM=395nm；

灵敏度：紫外0．16ATT，荧光0．08ATT；

记录仪灵敏度：紫外、荧光均为10mV；

纸速：8mm／min～4mm／min；

柱温：室温；

进样量：标准、样品均为20μL。

5．样品前处理

由于维生素B2及叶酸见光易分解，因此整个操作过程应避免阳光直射。称鲜样50～100g，在捣碎机中捣成匀浆后，称取10～20g(视B族维生素含量而定)，转移到150mL三角瓶中，加入0．4mol／LHCl溶液50mL(若为干样，磨碎过筛，均匀取样2～5g)，用牛皮纸或棉塞将三角瓶口扎紧，置15磅121℃的高压锅中水解30min，待水解液冷却后用重蒸水定容至100mL，先用定量滤纸过滤，上机前再用0．45μm的微孔滤膜过滤。

6．测定

样品经处理后，按色谱操作条件上HPLC进样量为20μL，根据标准的出峰时间，确定样品的峰，量出标准峰高和样品峰高，根据峰高计算样品中维生素含量。

7．分析结果的表述