氨基酸的纸上层析法测定蛋白质水解物的成分

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层析法又称色层分离法，一般认为纸层析是分配层析中的一种，但也并存着吸附和离子交换作用。

分配层析是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配系数不同而得到分离的，通常用α表示分配系数、

一个物质在某溶剂系统中的分配系数，在一定温度下是一个常数。

纸层析是以纸作为惰性支持物的分配层析，纸纤维上的－OH基具有亲水性，因此能吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相，有机溶剂自上而下流动，称为下行层析，自下而上流动，称为上行层析。流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提，使物质在两相之间不断分配而得到分离。

试剂

(1)氨基酸标准液：配制每毫升含1毫克的氨基酸标准溶液。(1毫克／毫升)。

(2)95%乙醇。

(3)80%甲醇。

(4)12%氨水。

(5)0．1%茚三酮丙酮溶液。

(6)0．5%茚三酮丙酮溶液。

(7)正丁醇(需重蒸馏，沸程：116～120℃)。

(8)0．1%硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)∶75%乙醇=2∶38。临用前按比例混合。

(9)5．7N重蒸盐酸溶液：将分析纯市售盐酸用磨口蒸馏器蒸馏，收集恒沸点部分，即为5．7N盐酸溶液。

(10)氨基酸混合液：每种氨基酸500微克／毫升。

操作步骤

1．蛋白质水解液的制备：称取5毫克蛋白质样品，置水解管内(或安瓿瓶内)，再加入2毫升重蒸馏的恒沸点盐酸(5．7N)，封口后置110℃烘箱中进行水解24小时，然后将水解液转移至小烧杯中，于沸水浴上蒸去盐酸，内容物蒸干后再加少量蒸馏水，再次蒸发，重复3～4次。最后加1毫升蒸馏水。

2．双向上行纸层析

(1)层析滤纸：28cm×28cm，在滤纸上距相邻的两边各2cm处用铅笔轻划一条线，在线的交点上点样。

(2)点样：将样品蛋白水解液，用微量进样器，点样，点样量15～20微升，分几次点样，每点一次用吹风吹干后，再点第二次。点样的扩散直径不得超过0．5cm(一般控制在2mm左右)。

(3)展层：双向展层。

a．第一相为碱系统：正丁醇∶12%氨水∶95%乙醇=13∶3∶3(体积比)

b．第二相为酸系统：正丁醇∶80%甲酸∶水=15∶3∶2(体积比)

第一相展层一次，必要时亦可展层两次，第二相一般展层一次。

展层条件：①碱溶剂系统：平衡溶剂为12%氨水，温度25℃，时间14～16小时。

②酸溶剂系统，平衡溶剂与展层溶剂相同。温度25℃，时间10～12小时。

使用的溶剂系统需新鲜配制，并要摇匀，平衡溶剂每烧杯放10毫升左右，展层溶剂每张约需25毫升。

进行双向层析时，先用第一向溶剂展层后，使干燥，将纸调转90°，再用第二向溶剂展层。当溶剂展开到距纸边0．5厘米时取出，用电吹风吹尽溶剂，滤纸干燥。

(4)显色：显色剂采用0．5%茚三酮丙酮溶液，用喷雾器将20m1茚三酮溶液均匀喷雾在纸上，滤纸悬挂在65℃的烘箱内，加热20分钟左右即可看到紫红色的氨基酸斑点。

3．氨基酸标准曲线的制作

(1)滤纸：同前

(2)点样：配制1mg／ml的天冬氨酸溶液，在纸上点不同的量：5，10，15，20微升，留一空白点作对照。点样操作同前。

(3)展层：展层用酸性溶剂系统，展层条件与操作见前。

(4)显色：用吹风机吹干净溶剂层析滤纸，用20毫升茚三酮丙酮溶液均匀喷雾、自然干燥后，置65℃烘箱内，烘30分钟取出。

(5)比色测定：剪下层析谱上天冬氨酸斑点。其面积大小相仿，再剪一块空白纸作比色对照。把剪下的纸片再剪成梳状细条，分别装入干燥试管内，加入5毫升0．1%硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)∶75%乙醇=2∶38的溶液洗脱。间歇摇荡，洗脱液呈粉红色。待15分钟后，用520nm波长在分光光度计上比色测定。

以氨基酸含量(微克数)为横坐标，光密度为纵坐标作图．其结果为直线关系，但不同氨基酸其斜率不同。

4．定性鉴定

(1)R_f值的计量：

用尺测量显色斑点的中心与原点(点样中心)之间的距离。再测量原点中心与溶剂前沿之间的距离。求出比值即得氨基酸的R_f值。

(2)双向层析R_f值由两个数值组成，即在第一相计量一次(碱系统)和在第二相计量一次(酸系统)，分别与已知氨基酸在碱、酸系统中的R_f值对比，即可初步确定它为何种氨基酸。

5．定量测定：找出各氨基酸的斑点，剪下，在同一张纸上再剪下一块大小相仿的空白纸作对照，用硫酸铜乙醇溶液洗脱并进行比色(操作同标准曲线)。所得光密度值，在标准曲线上查出相应氨基酸含量。并计算出样品中百分含量。