植物胁迫耐性突变体的选择

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(一)胁迫突变体

1．低温胁迫 Steponkus用洋常春藤愈伤组织为材料，作了选择抗低温细胞系的早期尝试。没有在再生的植株中表达，并能通过有性生殖周期传递。

组织培养体在适宜的温度下生长，并再度处于冷害胁迫下可以保留抗性特性，这并不是其遗传性的确切证据，因为后生遗传变化可在没有选择压力组织培养中传递几次。对于所报道的任何一个经组织培养选得的变异体，没有研究过其抗性的机理的生理基础，以鉴定这种获得性遗传的机制。而抗性植物，遇冷害时，由于膜拟脂中有较高比例的不饱和脂肪酸和固醇的含量，增高了对结冰低温的抗性。

用甲基磺酸乙酯处理过或未作处理的林烟草和辣椒悬浮细胞培养物在-3℃和5℃浸21天。对这样处理后活下来的细胞所产生的细胞系进行冷害处理，测定其抗性。某些细胞系当再次受胁迫时，生存率没有增高，而另一些细胞系在24℃生长一段时间后，仍然保持其抗性。诱变剂处理加强了分离到那样稳定的抗性细胞系。

在另一个实验中，林烟草的愈伤组织分别在0℃和-3℃进行冷处理21天。选择到抗冷性提高的细胞系：两个细胞系具有高度抗性，3个具有低水平的抗性。只从具较低抗性的细胞系成功地再生了植株。从再生植株的有性生殖后代所产生的组织培养物对于冷害的抗性比从敏感对照植物所发生的培养体没有任何提高。

2．盐类胁迫 Melchers(1972)讨论了组织培养技术在选择抗盐突变体中的好处。Zenk(1974)成功地用这一办法，从单倍体林烟草培养体中选到了能在含有0．17M NaCl的培养基上生长的细胞系，而对照细胞在这种培养基上不能生长。在含盐的培养基培养许多代这种细胞系的抗性是稳定的。

Nabors等把烟草细胞悬浮培养物用EMS处理，而后把其培养在含有0．03M NaCl的培养基上，从中选到了抗盐的细胞系。由此产生的细胞甚至可以抗培养基中高达0．09MNaCl。大多数对照培养物在含盐的培养基中不能生长。然而少数仍是活的，转代几次后开始快速生长，可用自发显性突变说明。

Dix和Street(1975)选择了能在含NaCl高达0．34M液体培养基中生长的许多林烟草和辣椒的细胞系。有些细胞系在不含NaCl的培养基中培养几代后仍保持抗性。从在含有0．34M NaCl的培养基中生产2或6代后，从所得到的抗性细胞系再生植株。对从这两组植物的叶子产生的愈伤组织测定其在NaCl培养基中生长能力。前一组植株的愈伤组织最多只表现出有限的局部生长，后一组植株的愈伤组织可与原来的抗性细胞系一样生长。

Croughan等(1978)从苜蓿的细胞培养物分离到能在含0．17M NaCl的培养基中生长的抗盐细胞。在某些方面的行为如同盐生植物，其最适生长需要盐，在有高水平的Na⁺存在时，K⁺也保持高水平，在低盐水平时提高NO₃-的水平，NO₃-可能取代Cl-。

Rains等(1980)从水稻选到的抗盐细胞系结果相同。在有0．26M NaCl(使未经选择细胞的致死浓度)存在时选到的细胞，最适生长需有0．09M NaCl存在。推测苜蓿和水稻经过选择与未经选择的细胞的离子运输系统是不同的。

Kochba等(1980)报道分离到提高对NaCl抗性的“Shamouti”甜橙愈伤组织系。从这种愈伤组织得到的胚仍保持抗性。

Nabors等(1980)报道从选择到的抗NaCl细胞再生的可遗传抗盐性。烟草细胞悬浮培养体在提高NaCl水平的培养基中，选择到能抗0．88%NaCl的细胞系。从培养体再生的植株经相继检测两代都保持抗性。再生植株后代的抗性水平高于原来的培养体。

Bressan等(1981)发现，从培养细胞中选到的抗干旱细胞(干旱由聚乙二醇所引起)对NaCl的抗性比未选择的细胞高。因此，应考虑非渗透性渗透剂在选择抗盐的渗透作用中的应用。

Goldner(1977)把在组织培养中选择到的可能的抗盐突变分成三大类：(1)抗渗透胁迫的突变，(2)抗由高浓度总盐分所引起的胁迫的突变，和(3)抗由特殊的离子引起的突变。他们提议为有效地选择每类这些突变应设计专门的程序。Zenk(1974)，Dix和Strcet(1975)和Nabors等(1975)用从悬浮培养体中选择抗NaCl的技术，适用于选择第一突变体。

3．干旱胁迫 Heyser和Nabors(1979)首次报道选择抗由聚乙二醇(PEG)所引起的胁迫的细胞系。Bressan等(1981)把细胞放在含有PEG的培养基中，选到了抗干旱的番茄细胞。选到的细胞系在含有不能渗透的渗透剂的培养基生长比未经选择的对照细胞快。然而，只有当细胞一直与PEG接触，这种抗性才是稳定的，如在培养基中没有渗透剂，很快会失去抗性。

(二)选择抗胁迫突变体的程序

所设计的从组织和细胞培养物发展抗胁迫突变体的所有程序都包括5个主要步骤：(1)从敏感植物准备愈伤组织和细胞悬浮培养物，(2)诱变处理，(3)选择，(4)测定在培养中保持抗性，(5)再生抗性的整体植株，和(6)遗传分开。除选择以外，所有其他步骤的程序都相同。

1．细胞培养物的准备

(1)愈伤组织和悬浮细胞培养体的准备几乎植株的任何器官都能发生愈伤组织。最常用于这一目的的器官是叶子。对于诱导和培养愈伤组织和悬浮培养物的最适培养基组成和培养条件的细节常因种甚至品种而异。Yeoman和Macicod(1977)对产生愈伤组织和Street(1977)对于悬浮培养体作了普遍性指导。所用的基本培养基是MS或LS，如果对于特定的种尚未研究出专门方法前，也常推荐这两种培养基作为出发点。对于不同植物类型发生变更的培养基成分通常是激素和维生素的质和量。

(2)叶子培养物的程序

A．愈伤组织培养

①从幼年植株取下完全展开的幼叶。

②把叶放在次氯酸钠(大约1%活性氯)中浸5min，同时经常搅拌。如果叶是从田间而不是从花房中取来时，需要更多的表面灭菌措施，包括次氯酸盐的浓度要增高，时间要加长，并加入几滴去垢剂，还要用70%乙醇处理。

③用无菌无离子水清洗叶(三次)。

④把叶切成小块(直径约为1-1．5cm)，把它放在100×15mm的塑料培养皿中的固体培养基上(含琼脂0．8-1%)。

⑤用石蜡膜把培养皿封边，进行培养。培养条件，包括光质、光强和光周期，温度，通常随不同种而有不同。

⑥把愈伤组织切下后，进行继代培养。愈伤组织通常在小块组织的四周发生，切下的愈伤组织培养在与培养叶切段相同成份的培养基中。

⑦每隔2-3周把生长最好和最快的愈伤组织转入新的培养基。重复转代3-4次。

B．悬浮培养

①把0．3g或更多(可达2g)的愈伤组织放入250ml三角瓶中，其中含有50ml液体培养基，把三角瓶放在旋转振荡器上。培养基的成分可与培养愈伤组织的一样，有时可对激素稍作变动。旋转的频率和培养条件，常因种而异。

②经常把静止期细胞以一个合适的接种密度转入新的培养基，以保存培养体。

(3)种子培养物程序

①把种子放入次氯酸钠(大约含有1%活性氯，加几滴去垢剂)中消毒20min。

②用无菌去离子水洗3次。

③把种子放入培养皿中的无菌纸上，保温发芽。不同种对光、温条件可能不同。

④切下展开的子叶，切成小块，用固体培养基接种，培养方法如上。

⑤应用上述叶子产生愈伤组织和悬浮培养物的相同步骤(第5-7和1-2)进行。

2．诱变剂处理

(1)处理悬浮培养物的诱变剂要无菌地加入。常用诱变剂是甲基磺酸乙酯，浓度为0．075至1．5%(v／v)处理60min。

(2)用细的尼龙布收集细胞，并用新鲜培养基洗两次。

(3)选择处理前至少在新鲜培养基中培养3天。

不用诱变剂处理也可获得抗逆自发突变。

3．选择 因为选择抗逆突变体的成功实验还极少。现阶段还不能作出概括。下列选择程序只能作为一般指导。因此，这将包括可能在每种情况下有植物种专化的细节。这些选择方法以1、2培养分离突变体的总的原则为基础。

(1)抗冷性(林烟草和Eopsicamannuum)

①把细粒悬浮体与38℃熔化的琼脂培养基(0．9%琼脂)混匀，细胞密度为10×10³至50×10³细胞／ml。

②立即把培养基倒入9cm培养皿中，每皿加10ml。

③封好培养皿，在25℃暗培5天。

④把平板放在低温下(对C．annuum为5℃，对于N．sylvestris至少0℃)21天，保持黑暗。

⑤把平板放到25℃，保持6周(C．annuum)和8-10周(林烟草)。

⑥把各个生长的群体从平板上转到瓶中的琼脂培养基上，25℃培养，以建立抗性细胞系。

(2)抗盐性〔紫苜蓿、林烟草和辣椒，Nicotiana Sylvestris(N)和Copsicum annuum(C)〕

A．固体培养基中选择

①把悬浮培养物放置5min，倒出大部分上清液，其中含有单细胞和小的细胞团。另一种方法是用0．6mm网眼的尼龙布过滤悬浮培养体(最近一次转代后7-10天)，用新鲜培养基洗留下的细胞。

②用分散的单细胞或小细胞团接种，培养皿中的琼脂固化培养基加0．17M NaCl(w／v)。或把细粒悬浮培养物与含有0．17或0．34M NaCl的熔化琼脂培养基(保持38℃)混匀，使细胞密度为25×10³至35×10³细胞／ml，倒入9cm培养皿，每只10ml。

③用石蜡膜封好培养皿，在60μE／m²·s的日光灯连续照光，温度27±1℃。

④当大多数细胞变成褐色并停止生长(盐分毒性的症状)时，把那些看起来还是健康的组织转至新鲜的含有0．17M NaCl培养基上(大约每5-6周继代一次)。

⑤在同样的含盐培养基上生长6-7代，生长良好，没有退色现象的，就是抗盐系。

B．液体培养基中选择(林烟草，辣椒)

①把细的单细胞和小细胞团悬浮液转入含有0．17或0．34M NaCl(w／v)的新鲜培养基中，密度大约为1×10⁵细胞／ml。

②培养21天后，转入含有相同水平的盐的液体培养基中，作为第一代，以后每21天继代一次，直至在NaCl存在下生长不断改善。

③把抗盐细胞培养体培养在瓶中的琼脂培养基上，从这些细胞发育成的群体切下小块，用以继代。即成抗盐细胞系。

用聚乙二醇处理细胞培养体也能得到抗盐细胞。这一途径采用选择抗干旱细胞的程序。

(3)抗干旱(番茄)

①把聚乙二醇(PEG，分子量6000-7000)溶解在浓度加倍的培养基中，再用蒸馏水调节到最终体积。

②用适当仪器测定含有不同用量的PEG培养基的起始水势。这是因为，PEG含量与水势不直接成比例，培养基的其他成份(如盐类和糖类)也影响水势。

③用一只砂芯玻璃漏斗从静止期的悬浮培养体收集细胞，把它放在125ml的三角瓶中，用含有15%PEG的新鲜培养基再悬浮，密度大约为0．2g／ml。

④放在一回转摇床振荡器(每分钟80-100转)上培养，温度26℃，每天16h光照(1500lx，用日光灯照)，8h暗期。

⑤按事先规定的时间，在布氏漏斗上用4号Whatman滤纸收集细胞。

⑥用测定鲜重或在烘箱中80℃烘过夜的办法测定干重，以此测定细胞的生长。

(4)抗离子(铝)(番茄)

A．愈伤组织

①把愈伤组织放在含有200μM铝(如Al-EDTA)的适当的培养基中，每培养皿5块(每块约重300mg)。

②用石蜡膜培养皿封边，在适宜光照和温度条件下进行培养。

③把愈伤组织块每隔28天转至新鲜的含有Al³⁺的培养基中，有规律地检查生长面积。

B．细胞悬浮培养物

①把1ml一份的细胞悬浮液涂布在含有200微克分子的铝的固体培养基的培养皿中。

②平板30℃，暗培，有规律地检查群体生长。

4．在培养条件下测定抗性的保持

(1)在没有选择剂的条件下培养抗性系的愈伤组织。

(2)过2-4代后，再把细胞放回选择剂中，测定其最大生长量。

5．再生植株

(1)把愈伤组织块移至诱导苗形成的培养基上，以诱导长芽，通常在培养中用相同的基本培养基。每种植物可能需要合适的激素组成。

(2)把苗移至含有适于诱导根发生的激素成份的培养基中，以诱导发根，这种激素成份对每类植物是不同的。

(3)把长根的植物移栽至盆中，长好以后再把其移至花房中。

6．遗传分析

(1)把从抗性的和敏感的培养体再生的植株培养至开花，进行自花授粉。把敏感和抗性的植株进行杂交，得到F₁代，从自交的F₁植株得到F₂代。

(2)把亲本植株和杂交后代植株放入各种逆境中，观察其反应。

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