尿素酶活性的测定

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尿素酶是在生大豆中发现的一种酶，尿素通过水解为含毒的氨，产生毒素。大豆或豆饼通过烘烤工序能破坏这种酶。

试剂

(1)二甲氨基苯甲醛溶液：称取1．6克二甲氨基苯甲醛，溶于100毫升95%乙醇中。加10毫升浓盐酸(可保存一个月)。

(2)焦磷酸盐缓冲液：称取23．3克Na₄P₂O₇·10H₂O，溶于约980毫升蒸馏水中，加3毫升浓盐酸，然后再加盐酸调节pH至7．7～7．8。稀释至1000毫升。

(3)缓冲尿素溶液：称取0．4克尿素溶于1000ml焦磷酸盐缓冲液中(可保存一周)。(0．4毫克／毫升)。

(4)醋酸锌溶液：称取22．0克醋酸锌(含2结晶水)溶于蒸馏水中，加3毫升冰醋酸，稀释至100毫升。

(5)亚铁氰化钾溶液：称取10．6克K₄Fe(CN)₆·3H₂O溶于蒸馏水，稀释至100毫升。

(6)活性炭。

操作步骤

1．样品处理：准确称取1．00克豆饼粉，置三角烧瓶中，加50毫升缓冲尿素溶液。在40℃下水浴半小时，不断摇振。取出迅速加入浓盐酸，亚铁氰酸盐溶液、醋酸锌溶液各0．5毫升。再加入活性炭0．1克。振摇15分钟后过滤。滤液如有色再加活性炭，重复上述过程。

2．标准曲线的绘制：吸取缓冲尿素溶液，0．0，2．0，4．0，6．0，8．0，10．0，12．0毫升，分别置于25毫升比色管中，加10毫升二甲氨基苯甲醛，用蒸馏水补足25毫升，混匀，在25℃下水浴10分钟，然后在430nm波长处测定光密度。

以光密度为纵坐标，尿素含量(微克／毫升)为横坐标，绘制标准曲线。

3．酶活性的测定

(1)吸取样品滤液10毫升，加10毫升二甲氨基苯甲醛溶液，置25毫升比色管中，用蒸馏水补足25毫升。

(2)空白：除不加样品滤液外，其余同上述样品滤液的操作。

(3)尿素标准液：吸取10毫升缓冲尿素溶液和10毫升二甲氨基苯甲醛，置25℃比色管中，用水补足至25毫升。

将上述比色管中溶液混匀，于25℃下水浴10分钟，然后在430nm波长处测定光密度。

4．计算：

式中A：标准曲线查得尿素标准液中尿素含量(微克／毫升)；

B：标准曲线查得样品中尿素含量(微克／毫升)；

W：样品重(克)；

50：1克样品作用于50毫升缓冲尿素溶液；

10：测定时取10毫升样品滤液。

〔注〕活力单位：1克样品中尿素酶于25℃，10分钟，水解尿素的微克数。