小鹅瘟琼脂扩散试验操作技术

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(一)材料准备

1．器材：培养皿、捣碎机、打孔器、毛细吸管、透析袋等。

2．药品：优质琼脂、氯化钠、氯仿、硅胶。

3．标准抗血清：抗小鹅瘟高免血清。

4．标准抗原：小鹅瘟病毒鹅胚尿囊液，作10^－2稀释接种12－13日龄鹅胚尿囊腔内，每枚0．2毫升，取接种后72－120小时之间死亡，且病变典型的鹅胚，除去头、肢、翼后，等量加入尿囊液混合捣碎成匀浆，冻融两次后，加入同体积的氯仿，振摇30分钟，经3000转／分离心30分钟，取上清液装入透析袋内，用干燥硅胶吸水，使浓缩为原液的二十分之一，即为琼脂扩散浓缩抗原。每毫升抗原含20万个鹅胚最小致死量。

5．被检鹅胚抗原：将病肝组织接种鹅胚，取死亡鹅胚组织制成抗原，方法同上。

6．被检病肝组织抗原：取被检病雏鹅的肝脏，加等量去离子水捣碎制成抗原，方法同上。

7．对照抗原：用发育16－18日龄鹅胚制成的抗原，方法同上。

8．琼脂配方：

琼脂糖 1克

氯化钠 8克

1%硫柳汞 1毫升

蒸馏水 100毫升

配制后调pH为7．8。

(二)操作方法

1．琼脂板的制备：将充分融化的琼脂糖倒入清洁平皿，制成3毫米厚的琼脂板，冷却后置4℃冰箱内保存。

2．打孔：琼脂板在临用前按7孔图型打孔，孔径为3毫米，孔距为4毫米。

3．加样：

(1)检测抗体：中央孔加入诊断抗原，周围孔间隔加入被检血清和阳性血清。本法用于免疫效果的检测抗血清质量的检测。

(2)检测抗原：中央孔加入标准抗血清，周围孔加入被检抗原和标准抗原。本法用于检测疫苗质量和快速诊断。

上述每孔加入量均为0．02毫升，加入后置20－25℃室温下，24小时后观察结果。

(三)结果判定

阳性：在中央孔与周围孔之间有明显的白色沉淀线出现，即为阳性反应。

阴性：在中央孔与阳性对照孔之间出现白色沉淀线，而中央孔与周围被检孔之间无沉淀线出现，即为阴性反应。