器材和试剂

---

1．器材

(1)圆柱电泳槽；

(2)凝胶电泳玻管 内径5－6mm，外径7－8mm，长度100mm，两端用金刚砂磨平。管的内径要均匀一致，最好由同一玻璃截断制成。用洗液浸泡，用水洗净烘干备用。

(3)小玻塞将直径与凝胶玻璃管相同的玻璃棒，截成约1cm长，两端磨平。用时以乳胶管与凝胶玻璃管相连。

(4)5或10ml注射器和1ml注射器。

(5)注射针头(20号)和10cm长注射针头(5或6号)。

(6)50或100μl微量进样器。

(7)电源：直流稳压电源，电压400－500V，电流100mA。

2．试剂

(1)0．2M、pH7．2磷酸缓冲液 取280ml0．2M磷酸二氢钠溶液，再加入720ml0．2M磷酸氢二钠溶液，混和均匀后在pH计上调至pH7．2。

(2)样品溶解液 0．01M，pH7．2磷酸盐缓冲液，内含有1%SDS，1%巯基乙醇，10%甘油，0．02%溴酚蓝。用来溶解待测样品。其配制方法如下：

SDS 100mg 甘油 1ml

巯基乙醇 0．1ml 溴酚蓝 2mg

试剂2 0．5ml，

最后加蒸馏水至总容积10ml。

(3)电极缓冲液为0．1%SDS，0．1M，pH7．2磷酸盐缓冲液取1g SDS，加入500ml试剂2，用蒸馏水定容至1000ml。

(4)染色液 称取0．25g考马斯亮蓝R－250，加入454ml50%甲醇水溶液和46ml冰醋酸。

(5)脱色液 75ml冰醋酸，875ml蒸馏水与50ml甲醇混合。

(6)SDS纯化 市售化学纯SDS需重新结晶后使用。重新结晶方法如下：称取20g SDS，放入500ml圆底烧瓶中，加进约半骨匙的活性炭及300ml无水乙醇，搅拌，摇匀。烧瓶上接上一个小冷凝管，放在水浴上加热至乙醇微沸，回流约10分钟。然后用热过滤漏斗热过滤。滤液应透明无色，并冷却至室温后，移至－20℃冰箱中过夜。次日，通过预冷的布氏漏斗抽滤。用少量－20℃无水乙醇洗沉淀3次，尽量抽干。将结晶置于真空干燥器中干燥或40℃以下烘箱中烘干。

3．操作方法

(1)贮液和凝胶的配制 贮液和凝胶溶液的配制方法如表11－2。

表11－2 贮存液及凝胶溶液的配制

表中：Acr：丙烯酰胺；Bis：甲义双丙烯酰胺；TEMED：N，N，N¹，N¹，一四甲基乙二胺。

注：贮液放置冰箱保存。SDS会在低温下析出，使用前用微温使溶化。贮液Ⅳ每二周新配一次。

SDS-PAGE电泳可采用圆柱电泳或垂直板电泳。本节将以圆柱电泳为例介绍如下。

将凝胶玻璃管插入电泳槽上槽底部的圆孔中，使其垂直。玻璃管底部套上小玻塞。在套上前在小玻璃塞的表面均匀地涂一薄层50%甘油。

从冰箱取出的贮液平衡到室温后，按上表中10%凝胶的比例混合。混合液置于真空干燥器中用水泵抽气10分钟后，加入10%过硫酸铵溶液，混匀后立即用细滴管将胶液加到凝胶玻璃管中，凝胶高度为7cm，尽量使每管凝胶高度一样，最好事先画好刻度。加完胶液后，立即用带有细针头的注射器沿管壁轻轻向胶面加入蒸馏水约3－4mm高度，静置数分钟后，水和胶界面消失，的20－30分钟重新出现界面，再放置30分钟即可加样。

制胶时须注意，向胶液表面加蒸馏水时，切忌水成滴坠入，而应沿管壁缓慢流下，否则，顶部凝胶浓度会有较大的稀释。这将影响样品的迁移率而降低测定结果的准确度。

(2)样品制备 一般是将蛋白质溶解在含有1%SDS、1%巯基乙醇的0．01M pH7．2的磷酸盐缓冲液中，在100℃加热2－5分钟。蛋白质的最后浓度一般为0．05－1．0mg／ml。

据S．F．Gardiner等(1986)研究，羊茅和黑麦草种子可用十二烷基硫化钠缓冲液提取。鸭茅醇溶蛋白提取是称取40mg粉，加入0．8ml按1∶1比例混合40m M Tris－硼酸缓冲液(pH8．6)和2%β－巯基乙醇在50℃浸提1小时。经研磨离心，再加入0．2M15μl二硫苏糖醇混合提取30分钟，再加15μl0．5M碘乙酰胺进行蛋白质乙酸化，再移入4℃下渗析一夜，离心，使用前放在85℃水浴里加热10分钟。

处理好的样品提取液可用于电泳。对于直径为6mm的凝胶柱管加10μg蛋白质(或更少)便可以得到清晰的区带。根据样品溶液的浓度，加样体积可由10－150μl。

经处理好的样品提取液也可放在冰箱中保存较长时间，使用前在100℃水浴中加热1分钟，以除去可能出现的亚稳态聚合物。

(3)电泳 轻轻取下凝胶管底部的小玻塞。注意保持玻管垂直装置在电泳槽上，将电泳槽倾斜过来，使凝胶管口斜向下方，用滴管轻轻吸去流到胶管口的水。先将电极缓冲液倒入下槽，并将上槽轻轻放下，稍转动，以除去凝胶管底部可能有的小气泡。也可用带弯的滴管轻轻吸去。然将电极缓冲液注入上槽，必须满过管口。

用微量进样器按号向凝胶管中加样。每管加一种样品。各加20μl(含蛋白质10μg)，稀溶液最多可加150μl。

加样完毕后，打开直流稳压电流(负极接上槽，正极接下槽，事先接好)。将电流调到每管8mA，保持电流强度不变。待指示染料(已事先加在样品溶液中)，迁移到离下口约1cm处时，停止电泳，约需4．5－5．0小时。

(4)染色和脱色 从电泳槽上取下凝胶管，用带有细长针头的注射器吸满蒸馏水，插入凝胶与管壁之间，一面轻轻旋转玻璃管，一边推针前进，并注水，使凝胶剥离璃管而滑出。在染色区带中心插入细铜丝作标记，按编号放入试管，加入染色液，染色4小时或过夜。次日倒去染色液，用蒸馏水漂洗胶柱数次后加入脱色液，数小时换一次脱色液，直至背景清晰，约需一昼夜。

【参考文献】：

〔1〕颜启传(1984)，杂交水稻及其三系种子的真实性和纯度检验，《种子》1984年第3期第15－18页。

〔2〕颜启传(1984)，应用聚丙烯酰胺凝胶酯酶同工酶垂直板电泳鉴定杂交水稻及其三系种子真实性和纯度，《浙江农业科学》，1984年第4期第196－199页。

〔3〕颜启传(1986)，水稻杂交种及其三系种子鉴定技术的进展，《种子世界》，1986年第8期，第2－3页。

〔4〕颜启传、黄亚军(1986)，杂交玉米吉单101及其亲本自交系种子真实性和纯度测定技术的研究，《种子》，1986年第5期，第12－15页。

〔5〕帅素云等(1983)，用酯酶同工酶分析法鉴定杂交水稻种子纯度，《江苏农业科学》，1983年第9期第16－20页。

〔6〕陆士伟等(1982)，应用酯酶同工酶测定水稻杂交纯度的研究，《中国农业科学》，(9)：10－15。

〔7〕汪德耀主编(1981)，细胞生物学实验指导，人民出版社，第377－385页。

〔8〕张龙翔等主编(1981)，生化实验方法和技术，人民教育出版社，第99－111页。

〔9〕上海植物生理学会编(1985)，植物生理学实验手册，上海科技出版社，第470－490页。

〔10〕美M．J．Siciliano等编(1980)，凝胶上酶的分离和显现，《植物生理学通讯》，第4期，第59－68页。

〔11〕南京大学生物系编(1979)，生物化学实验，人民教育出版社，第64－71页。

〔12〕胡能书、万贤国编(1985)，同工酶技术及其应用，湖南科学出版社。

〔13〕陆士伟、赖天斌编着(1987)，同工酶在农业上的应用，广东科技出版社。

〔14〕华家圣等(1979)，实用蛋白质化学技术，上海科技出版社。

〔15〕孙敬三等(1987)，植物细胞学研究方法，科学出版社。

〔16〕C．C．赖德等(1987)，同工酶，科学出版社。

〔17〕H．Stegemann et al(1985)，Gel Electrophoresis and Isoelectric Focusing，Institnt fur Biochemie，West Germany．

〔18〕S．R．Draper(1987)，Standard Reference for the Identification of Cultivars of wheat and Barley by Polyacrylamide Gel ElectrophOresis．Seed Sci．& Technol．15：431—434．

〔19〕A．C．DEDALE，el al(1982)，A Revised glasscation of wheat gliadin electropherograms，J．natn．Inst．agric．Bot．16：53—60．

〔20〕A．Clydesdale el al(1982)，A Standard method for the identification of wheat varieties by electrophorosis of their gliadins，J．natn．Inst．agric．Bot．16：16—66．

〔21〕Hans Doll et al(1981)，Preparation of Barley stora geprotein，Hordein，for AnalyticaI Sodium Dodecyl Sulfate—polyacry]amide gel electrophOresis．Analyrical Biochem ical，115：61—66．

〔22〕S．R．Draper et al(1984)，Biochemical Tests for Cultivar IdentificatiOil ISTA．

〔23〕B．J．Cardy et al(1984)，Identification of Soybeon Cultivars using isoenzyme electrophoresis，Seed Sci．& Technol．12：943—954．

〔24〕Arnoldl，Larsen(1966)，A distinction bet ween proteins of annual and perennial ryegrass seeds，Proc．Association official Seed Analysis．56：47—51．

〔25〕D．Blogg et al(1982)，Starch gel electrophoresis for Soybean Cullivar identification，Seed Sci．& Technol，10：19—24．

〔26〕H．J．Andersen(1982)，Isoenzyme character of 47 barley Cultivars and their application in Cultivar identification，Seed Sci．& Technol，10：405—415．

〔27〕T．J．Gilland(1982)，Evaluation of phosphogluccisenrase allaenzyme electrOphoresis for the identification and registration of Cultivars of Perenn i al ryegrass．Seed Sci．& Technol．10：415—430．

〔28〕M．B．German et al(1977)，Variety—Specific electro phoresis Variants of four Soybean enzyme．Crop Sei．，7：963—965．

〔29〕A．L．Iarson(1967)，Elcctrophoretic differences in Seed protein among varieties of Soybean，Crop Sci．7：311—313．

〔30〕B．A．Mardyle et al(1980)，Barley caltivars identification by electrophoretic analysis of hordein proteins．

I．Extraction and separation of hordein proteins and exeronmental-effects on the hordein electrophoregam，Can．J．plant Sci．，60：1343—1350．

〔31〕B．A．Marchyle．eL al(1981)，Barley Cnltivars identifi cation by electrophoretic analysis of hordein prote．ins．Calalogus of electrophoregam for mulae barley Cultivars，Can．Plant Sci．，61：859—870．

〔32〕C．A．Wilkinson，et al(1985)，Polyacrylamide gel electrophoresis for Cultivat identification in tobaco，Crop Sci．，25：971—974．

〔33〕J．F．Wikson et al(1972)，Electrophoretic identification of Agestis palustris and pea pransis CulLivars，Crop Sci．，12：833—834．

〔34〕C．W．Wrigley(1983)，Identification of Cereal varieties by gel electrophQresis of the grain Proteins．Advances in ScienOe and Technology．

〔35〕S．E．Gwrdiner(1986)，SDS polyacrylamide gel electrophoresis of grass Seed prote ins：A method for Cnltivar identification of pasture grass，ISTA 21 Congress，Ⅱ(99)．