叶酸的测定(荧光法)

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植物组织中叶酸的测定常采用此法，叶酸中具有吡嗪－嘧啶环，在紫外光照射下产生蓝色荧光，这一特性可用于叶酸的定量测定。

试剂

(1)40%偏磷酸溶液。

(2)20%醋酸溶液。

(3)4%高锰酸钾溶液。

(4)3%过氧化氢。

(5)叶酸标准液。

贮备液：称10mg纯叶酸，溶于100毫升水中(此为100微克／毫升)。置棕色瓶避光保存。

工作液：吸取1．0毫升贮备液用pH4．5稀醋酸稀释至50毫升(此液为2微克／毫升)。

(6)氨的乙醇溶液：3%氢氧化铵－70%乙醇溶液。

(7)活性炭(吸附剂)：称活性炭若干，加入10倍其重量的10%苯胺水溶液，加热煮沸1小时，过滤．用水洗5～6次，于30℃～40℃干燥备用。

操作步骤

1．样品液的提取：称适量试样(约含叶酸2～3μg)与石英砂在研钵中研磨后转入150毫升锥形瓶中，加入75毫升40%偏磷酸，在沸水浴上保温45分钟，冷却后稀释至100毫升，混匀，过滤。

2．提取液的纯化

(1)吸取50毫升提取液，加入100毫克活性炭，混匀，煮沸5分钟。用3号微孔玻璃漏斗抽滤，弃去滤液，再用60℃～70℃3%氢氧化铵－70%乙醇溶液洗滤渣5次，洗提液的总量约为70毫升，将洗脱液在水浴上蒸发浓缩至10毫升左右，然后用25%酷酸调节至pH3．0。

(2)将上述溶液滴入4%高锰酸钾液，直至高锰酸钾红色不褪为止。静置10分钟，此时溶液呈浅棕红色。

(3)向溶液中滴加3%过氧化氢溶液，使溶液颜色褪去。调节至pH4～4．5，定容至25毫升，过滤，备用。

3．测定

(1)将上述滤液置荧光比色皿中，以365nm射线激发，测定样液在470nm处的荧光强度。

(2)取叶酸标准溶液(2微克／毫升)及试剂空白溶液，按上述同样步骤处理，测定标准溶液及试剂空白溶液的荧光强度。

(3)试样溶液和标准溶液的荧光强度分别减去试剂空白的荧光强度进行定量。

4．计算：

式中．E₁：样品管荧光强度；

E₂：空白管荧光强度；

E₃：标准溶液荧光强度；

C：标准溶液浓度(微克／毫升)；

V₁：测定样液体积(毫升)；

V₂：稀释液体积(毫升)；

W：样品重量(克)。