(2)棉籽、植株和土壤中残留量检测方法(方法一)

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山东省农业科学院中心实验室 陈子雷 王文博 陈琦 丁蕊艳 李瑞菊

样本用混合溶剂提取，硅胶柱层析净化，液相色谱法(UV)测定。

1．主要仪器及设备

液相色谱仪 紫外检测器(UV)

高速匀浆机 8000～24000r／min

固相萃取装置

超声波清洗器

往复旋转式振荡器

层析柱 3mLSPE空管柱

2．主要试剂

甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)、丙酮(重蒸)、二氯甲烷(重蒸)、正己烷(重蒸)、石油醚(30～60℃，重蒸)、盐酸、氢氧化钠、醋酸铵、氯化钠、无水硫酸钠

层析硅胶10～40μm，150℃处理5h，冷却后，加5%水减活，密封保存

溶剂❶  甲醇／5%氯化钠／1mol／L氢氧化钠(65∶27∶8，V／V／V)

溶剂❷  0．16mol／L盐酸／5%氯化钠

溶剂❸  0．04mol／L盐酸／5%氯化钠

溶剂❹  甲醇／5%氯化钠(70∶3，V／V)

XDE-105Factor A和Factor D标准品 75．5%+14．4%

XDE-105Factor B标准品 94．0%

XDE-105Factor B of Factor D标准品 97．4%

3．检测步骤

3．1 提取

3．1．1 土壤

称取20g样本于250mL三角瓶中，加入50mL×2溶剂❶ ，超声提取，每次15min，过滤。残渣用20mL×2溶剂❶ 洗涤。合并滤液于250mL量筒中，用溶剂❶ 定容至150mL。

3．1．2 棉叶

称10g棉叶样本于广口瓶中，准确加入100mL溶剂❶ ，以20000r／min匀浆1min，静置过滤于100mL具塞量筒内。

3．1．3 棉籽

称取10g粉碎好的棉籽样本，准确加入100mL石油醚／丙酮(60∶40，V／V)，振荡30min，再用超声波提取10min，过滤。取50mL，用旋转蒸发器(45℃)浓缩至干，用50mL石油醚溶解。

3．2 净化

3．2．1 液-液分配

3．2．1．1 土壤、棉叶

取75mL土壤提取液于500mL分液漏斗内，加入75mL溶剂❷ (棉叶提取液50mL加50mL溶剂❷ )，用1mol／L盐酸调节pH至2。加入50mL石油醚，振荡洗涤30s，弃去石油醚相。下层水相用1mol／L氢氧化钠调节pH至10～12，用50mL×3石油醚，用力振荡提取，每次30s。合并石油醚相，经无水硫酸钠层脱水，用旋转蒸发器(45℃)浓缩至近干，用10mL正己烷溶解，待柱层析净化。

3．2．1．2 棉籽

将棉籽提取液转入250mL分液漏斗内，先后用30mL溶剂❹ 和30mL溶剂❸ 冲洗三角瓶并转入分液漏斗中，轻轻振摇30s，弃去石油醚相。水相中加入4mL1mol／L氢氧化钠调节pH至10～12，用50mL×3石油醚萃取，石油醚相经无水硫酸钠脱水后合并，用旋转蒸发器(45℃)浓缩至近干，用10mL正己烷溶解，待柱层析净化。

3．2．2 柱层析净化

称取0．8g硅胶填装于层析柱中，依次用10mL二氯甲烷／甲醇(3∶1，V／V)、6mL乙腈、6mL二氯甲烷和20mL正己烷预淋。将待净化的正己烷溶液加入柱中，用10mL×2正己烷冲洗蒸馏瓶并用于淋洗，弃去。用6mL二氯甲烷／甲醇(3∶1，V／V)洗脱并收集于离心管中，用旋转蒸发器(45℃)浓缩至干，用2mL乙腈／甲醇／2%醋酸钠(1∶1∶1，V／V／V)定容，待测定。

3．3 液相色谱法测定

检测器 UV

波长 250nm

色谱柱 HypersilODS₂C₁₈RP-Column，250mm×4．6mm，0．5μm

柱温 30℃

流动相 泵A，2%醋酸铵／乙腈(189∶1500，V／V)；泵B，甲醇

流速 泵A，0．48mL／min；泵B，0．32mL／min

进样量 10μL

保留时间 XDE-105Factor A约为10．90min，D约为12．71min，B约为8．83min，B of D约为10．20min

4．结果计算

外标(峰面积)-标准曲线法定量

5．灵敏度、准确度和精确度

最小检出量 9×10^－11g。

最低检测浓度 棉籽、棉叶0．04mg／kg，土壤0．02mg／kg。

回收率 土壤中添加多杀菌素0．05～0．5mg／kg时，平均回收率为72．4%～102．2%；棉叶中添加多杀菌素0．1～2．0mg／kg时，平均回收率为69．0%～108．0%；棉籽中添加多杀菌素0．1～2．0mg／kg时，平均回收率为77．3%～96．0%。见表1-31-3、表1-31-4、表1-31-5。

相对标准偏差 0．8%～17．1%。见表1-31-3、表1-31-4、表1-31-5。

表1-31-3 土壤中多杀菌素添加回收率及相对标准偏差实验结果